CHAPITRE II :

LES METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE

OBJECTIFS
- Décrire le principe et le rôle de la fixation des cellules et tissus ;
- Expliquer la différence de pouvoir de résolution des microscopes par rapport
aux yeux et loupe ;
- Décrire le principe des différentes méthodes de séparation ;
- Enumérer au moins 4 méthodes utilisé pour étudier les cellules et tissus ;
- Enumérer 3 applications médicales de la connaissance des méthodes d’études
des cellules et tissus.
PLAN
Introduction
1. Préparation des échantillons en vue d'une étude en microscopie optique
2. Etude microscopiques
3. Histochimie et cytochimie
4. Méthode de séparation
5. La culture cellulaire
Conclusion

INTRODUCTION
L’une des caractéristiques de la biologie cellulaire, est la progression de ses
connaissances qui à été dépendante de l’utilisation combinée de plusieurs groupes de
méthodes et techniques, morphologiques, biochimiques, électrophysiologiques,
biophysique, de biologie et génétiques moléculaires …etc. Ce chapitre ne peut être
exhaustifs, ne sera traité que les parties concernant les préparations des échantillons et
l’étude des structures avec le microscope.
1. PREPARATION DES ECHANTILLONS EN VUE D'UNE ETUDE EN
MICROSCOPIE OPTIQUE

Figure 1 : les étapes de préparation d’un échantillon pour observation

microscopique
1.1. Prélèvement

Figure 1 : image montrant une biopsie rénale

1.2. Fixation
La fixation va permettre de préserver les structures cellulaires, d'inactiver les enzymes
(ce qui va bloquer les processus de décomposition enzymatique post-mortem) et de
favoriser les colorations en rendant les cellules plus perméables. Les fixateurs les plus
couramment utilisés sont le paraformaldéhyde, le formol, les mélanges acide
acétique/méthanol. Le paraformaldéhyde et le formol insolubilisent les protéines en
créant des ponts méthyl entre les groupements amines libres des protéines. Ce sont des
fixateurs couramment utilisés mais ils ont tendance à masquer certains sites
antigéniques.

Figure 2 : principe chimique de fixation des tissus

1.3. Les techniques de préparation des cellule et tissus pour la microscopie/
techniques de fixation-inclusion-coupe-coloration/contraste
- Microscopie optique
Les tissus fixés sont ensuite inclus dans des blocs de paraffine afin de faciliter la
réalisation de coupes ultrafines au microtome. La paraffine est hydrophobe et n’est
donc pas miscible (Ne peut être mélanger) avec l'eau contenue dans les organes. Par
contre, la paraffine est soluble dans des solvants organiques tels que le toluène. Avant
l'inclusion, les tissus sont déshydratés à l'aide de bains successifs d'éthanol de
concentration croissante (70, 95 puis l00°) puis de toluène. Le tissu est ensuite plongé
dans un bain de paraffine à 56°C puis refroidi de manière à obtenir un bloc de paraffine
solide dans lequel l'échantillon est inclus. Les blocs sont coupés à l'aide d`un microtome,
un appareil muni d`un couteau en acier permettant de réaliser des coupes de 2 à 5 cm
d'’épaisseur. Les coupes de tissus sont ensuite collées sur des lames de verre. Il est
également possible de fixer les tissus par congélation rapide. Les échantillons sont
préalablement placés dans un agent cryoprotecteur comme le sucrose ou le glycérol pour
éviter la formation de cristaux de glace. Ils sont plongés dans une solution d"isopentane
refroidie par de l'azote liquide. La congélation permet de préserver l'intégrité des
protéines et donc les activités enzymatiques. Les tissus congelés sont coupés avec un
microtome à congélation ou cryostat qui est maintenu à une température comprise entre
-20 et -30° C. Les coupes à congélation (de 5 à 10 μm d'épaisseur) sont déposées sur des
lames de verre. Cette technique permet une bonne préservation des sites antigéniques et
des lipides ainsi que l'analyse des activités enzymatiques cellulaires.
Une fois coupés, les échantillons peuvent être colorés pour mettre en évidence certains
composants cellulaires. Les coupes issues des échantillons paraffinés doivent être
déparaffinées à l’aide de toluène puis réhydratées dans des bains d`alcool à degrés
décroissants (l00, 95 et 70°) puis d'eau. Parmi les colorations couramment utilisées en
histologie on peut citer :
✓ Le mélange éosine-hématoxyline-safran (HES), utilisé pour visualiser
l’architecture du tissu. L’hématoxyline colore les noyaux en bleu, l'éosine colore
les composants basiques cytoplasmiques et extracellulaires en rose et le safran
colore les fibres de collagène en jaune orangé.
✓ Le trichrome de MASSON composé d’hématoxyline, de fuchsine acide et de vert
lumière permet de colorer respectivement les noyaux en brun, le cytoplasme en
rouge et les fibres de collagène en vert.
✓ La coloration de MAY-CRUNWALD-GIEMSA (MGG) est utilisée
principalement pour différencier les cellules sanguines
✓ L’orcéine est utilisé pour mettre en évidence les fibres élastiques.
- Microscopie électronique
Les tissus sont généralement prélevés et conservés par fixation d’abord dans du
glutaraldéhyde qui relie transversalement et de façon covalente les molécules protéiques
voisines, puis dans du tétroxyde d’osmium, qui s’unit aux bicouches lipidiques et aux
protéines et les stabilise. Les prélèvements sont ensuite rincés puis déshydratés et inclus
dans des résines. Le bloc de résine contenant l’objet est taillé, placé dans un porte-bloc
de l’ultramicrotome et coupé avec une fine lame de verre. Les coupes ultrafines obtenues
sont traitées par des sels de métaux lourds (acétate d’uranyle, citrate de plomb) qui se
fixent préférentiellement sur certaines structures. Les sels fixés absorbent plus ou moins
les électrons et renforcent le contraste de l’image obtenue sur l’écran fluorescent. En
effet, le contraste en ME dépend du numéro atomique des atomes de l’échantillon : plus
le numéro atomique est élevé, plus les électrons sont éparpillés et le contraste est grand.
Les tissus biologiques sont composés d’atomes ayant un très faible numéro atomique
(surtout de carbone, de l’oxygène, de l’azote et de l’hydrogène). Pour les visualiser, ils
sont imprégnés, généralement après la coupe, de sels de métaux lourds comme
l’uranium et le plomb. Les différents constituants cellulaires sont révélés avec divers
degrés de contraste selon leur degré d’imprégnation avec les sels de métaux lourds.
2. ETUDE MICROSCOPIQUES
La limite de résolution de l'œil humain, c'est-à-dire la faculté de reconnaître comme
distincts 2 particules proches, est de 0,1 mm. La taille d`une cellule procaryote est de
l’ordre du micron et celle d`une cellule eucaryote est de quelques dizaines de μm (10 à
200 μm). L’étude de l'architecture cellulaire et tissulaire nécessite donc l'utilisation d'un
microscope. Les microscopes utilisent la déviation d'un flux ondulatoire de particules
constitué, soit de photons (microscopie optique ou photonique), soit d'électrons
(microscopie électronique) au travers d’un système de lentilles de manière à former une
image agrandie d'un objet.
1 m = 103 mm / 1 m = 106 μm / 1 m = 109 nm
2.1. Microscope optique ou photonique en lumière transmise
Le microscope optique permet de grossir les cellules jusqu’à 1000 fois, et d’obtenir une
résolution des détails de 0,2 μm (limite imposée par la nature ondulatoire de la lumière
et non par la qualité des lentilles). Trois choses sont nécessaires pour voir une cellule au
microscope. Premièrement il faut une lumière vive qui doit être focalisée sur
l’échantillon par des lentilles situé dans le condenseur. Deuxièmement l’échantillon doit
être soigneusement préparé pour permettre à la lumière de passer au travers.
Troisièmement, un jeu adapté de lentilles (objectif et oculaires) doit être monté pour
focaliser, au niveau de l’œil, l’image de l’échantillon.
Le microscope optique en lumière transmise permet d’étudier les cellules fixées (tuées
sans modifications essentielles de leur structure). La microscopie optique est fondée sur
l’utilisation de la lumière et de lentilles optiques pour permettre l’observation
d’éléments non visibles à l’œil nu. Dans la microscopie optique conventionnelle, une
source lumineuse est concentrée par une lentille spéciale appelée condenseur.
La lumière traverse le spécimen biologique par en dessous (celui-ci se trouve sur une
lame de verre qui est elle-même disposée sur la platine du microscope) puis une autre
lentille appelée objectif. Ensuite, elle est mise au point sur le plan focal et l’image est
visualisée à travers une lentille oculaire. Les deux propriétés importantes d’un
microscope optique sont le grossissement et la résolution (capacité de distinguer deux
objets contigus). Le grossissement dépend des caractéristiques physiques de la lentille
objectif et de la lentille oculaire et peut atteindre jusqu’à un facteur 1000.

Figure 3 : Statif du microscope. A : statif ; B : tête; Oc : oculaires ; C : tourelle

revolver ; Obj : objectifs ; D : platine ; G : diaphragmes ; F : condenseur E : lampe.
2.2. Microscope à fluorescence
Cette méthode microscopique permet de visualiser des substances spontanément
fluorescentes ou colorées par des molécules fluorescentes. Les molécules fluorescentes
sont capables d’absorber une lumière de longueur d’onde spécifique et émettent une
lumière de longueur d’onde différente qui fait partie de spectre visible. Un microscope
optique à fluorescence va tout d’abord consister en une source de lumière de différentes
longueurs d’ondes. Cette lumière traverse ensuite un filtre excitateur qui ne va laisser
passer qu’une seule longueur d’onde. Celle-ci va être réfléchie par un filtre
dichromatique vers le spécimen biologique. Les molécules fluorescentes dans la cellule
sont alors excitées et elles émettent une lumière visible qui va être concentrée par une
lentille objective. Un filtre supplémentaire arrête toute lumière résiduelle qui possède la
fréquence de l’onde lumineuse excitatrice. La seule lumière visible qui passe à travers
la lentille oculaire est celle émise par le composé fluorescent. Les composés fluorescents
exogènes les plus utilisés sont la rhodamine (qui produit une lumière rouge) et la
fluorescéine (qui produit une lumière verte). L’image la plus commune de l’auto
fluorescence est la fluorescence faible et bleutée du cytoplasme et la fluorescence jaune
des granules cytoplasmiques.
2.3. Microscope électronique à transmission
Le principe de la microscopie électronique est de concentrer un faisceau
d’électrons sur le spécimen biologique. Les électrons qui frappent le spécimen
biologique sont plus ou moins diffractés par les diverses structures cellulaires selon leur
densité. Les électrons qui ne sont pas diffractés sont dirigés sur un écran qui produit
alors une image alors que les électrons diffractés n’atteignent pas l’écran ce qui va
résulter en une zone sombre sur l’écran. Une lentille électromagnétique condenseur
concentre le faisceau d’électron sur le spécimen biologique. Des lentilles objectifs et
une lentille projecteur concentrent les électrons sur un écran.
2.4. Microscope électronique à balayage
Le microscope électronique à balayage produit directement une image de la
structure tridimensionnelle de la surface de l’échantillon. Le spécimen biologique est
préalablement vaporisé avec un métal lourd avant d’être disposé dans le microscope
électronique puis balayé par un faisceau d’électrons. Les molécules de métal recouvrant
le spécimen sont alors excitées et émettent des électrons secondaires qui sont concentrés
sur un détecteur à scintillation. Le signal résultant est envoyé vers un tube cathodique et
observé sur un écran. On peut obtenir une vue tridimensionnelle du spécimen
biologique.
3. L’histochimie
« L’histochimie est l’étude de la composition chimique des cellules, des divers tissus
vivants et des réactions chimiques cellulaires et tissulaires au cours des processus
métaboliques ». Les techniques histochimiques permettent de reconnaitre
spécifiquement des groupes chimiques ou des substances et de les localiser d’une
manière précise. Elles offrent la possibilité d’étudier et de reconnaitre la répartition des
acides nucléiques, des lipides, des glucides, des protéines dans la cellule, de localiser
des enzymes.
3.1. Détection des groupes chimiques spécifiques
L’utilisation de colorants liposolubles permet de localiser les lipides dans les cellules.
Le tissu est congelé puis coupé à l’aide d’un microtome à congélation puis les coupes
sont plongées dans des colorants liposolubles (exemple : rouge Soudan…).
3.2. Localisation des enzymes actives
L’étude de la distribution d’une enzyme (phosphatases acides, ATPases...) se fait
sur des coupes de tissus frais préparées au microtome à congélation. Ces coupes sont
placées dans un milieu contenant le substrat de l’enzyme. L’enzyme réagit avec le
substrat et il se forme un produit de réaction primaire insoluble qui peut être mis en
évidence par coloration.
3.3. Marquage des molécules
Le marquage des molécules est la fixation sur une molécule, d’un signe de
reconnaissance facilement identifiable qui autorise le suivi d’un composé dans un
organisme, un organe, un tissu ou dans une cellule. Le marquage utilise soit les isotopes
radioactifs (autohistoradiographie), soit des substances fluorescentes.
4. LES METHODES DE SEPARATION
4.1. Sédimentation, centrifugation, ultracentrifugation
- Elle est basée sur un principe analogue : séparation des particules en suspension sous
l’effet d’une accélération ;
- Particules en biologie : cellules, composants cellulaires, macromolécules.
a. Sédimentation
✓ Définition : processus de dissociation par phénomène de gravitation ;
✓ Principe : dépôt graduel de particules solides en suspension dans un liquide
au fond du récipient dans un mélange au repos sous l’effet de la pesanteur.
b. Centrifugation-ultracentrifugation
✓ Définition : séparation de différentes substances grâce à une force centrifuge
par un mouvement de rotation ;
✓ Principe : dépôt graduel de particules solides en suspension dans un liquide
au fond du récipient grâce une force centrifuge induite par un mouvement de
rotation.

c. Electrophorèse :
✓ Définition : séparation de particules chargées par migration sous l’effet d’un
champ électrique.
Principe : déplacement de molécules chargées dans un champ électrique continu
d. Chromatographie :
✓ Définition : Procédé qui permet de séparer les composants d’un mélange en
utilisant une association de principes diversifiés. Les composants séparés se
distinguent l’un de l’autre par leur différence d’apparence de couleur → d’où
le nom.
✓ Chromatogramme : image, diagramme obtenu
 e. Le fractionnement cellulaire (le fractionnement cellulaire par
centrifugation)
Les cellules peuvent être soumises à un choc osmotique ou à une vibration ultrasonique
ou broyées dans un milieu d’homogénéisation. Ces techniques cassent en général la
membrane plasmique et la membrane de RE en fragments qui se referment aussitôt pour
former des petites vésicules en laissent les organites intacts. L’homogénat obtenu
contient une variété d’organites entourés de membranes, chacun de taille, de forme et
de densité distinctes.
La centrifugation est la première étape de presque tous les fractionnements mais elle ne
sépare que les composants qui différent grandement par leurs tailles. Un degré plus fin
de séparation peut être obtenu en déposant l’homogénat en une couche fine au-dessus
d’une solution diluée de sel (chlorure de césium) remplissant un tube à centrifuger.
Apres centrifugation, les divers composants se déplacent en une série de bandes
distinctes à travers la solution saline, chacun à une vitesse différente, selon un processus
appelé sédimentation de vitesse.
L’ultracentrifugation est également utilisée pour séparer les composants cellulaires sur
la base de leur densité de flottaison qui est indépendante de leur taille et de leur forme.
L’échantillon sédimente à travers un fort gradient qui contient de fortes concentrations
de saccharose ou de chlorure de césium. Chaque composant cellulaire contenu dans le
tube finit par flotter à sa position d’équilibre. Cette position d’équilibre correspond à
une zone du tube ou la densité de la solution est égale à celle du composant concerné.
Une série de bandes distinctes est produite dans le tube à centrifuger avec les bandes
les plus proches du fond du tube contenant les composants des plus fortes densités de
flottaison : cette méthode est appelée sédimentation à l’équilibre.

Figure : centrifugation successive à accélération croissante

5. LES CULTURES CELLULAIRES
Les cellules en culture fournissent une population cellulaire à partir de laquelle on peut
extraire des matériaux et sont pratique à manipuler au laboratoire. Dans un milieu
approprié, dans une boite pour culture cellulaire, la plupart des cellules peuvent vivre et
se multiplier. Les cellules peuvent être observées en continu au microscope ou analysées
biochimiquement et les effets de l’addition ou de retrait de molécules particulières
peuvent être explorés. Les cultures cellulaires offrent la possibilité de comprendre le
fonctionnement cellulaire et de poursuivre des expérimentations sur du matériel en
dehors de l’organisme dont elles sont issues. Ces techniques permettent d’étudier les
cellules vivantes soumises à des conditions variées.
CONCLUSION
L’observation de cellules vivantes est possible si on utilise des marqueurs et/ou colorants
ou des dispositifs physiques appropriés ajoutés au microscope photonique, En générale
le matériel biologique doit traiter pour pouvoir être transformé en coupes fines ou ultra
fines et transparentes, qui sont ensuite colorés.