UNIVERSIDAD ESTATAL DE MILAGRO
FACULTAD CIENCIAS DE LA INGENIERIA
CARRERA: Ingeniería en Biotecnología
MATERIA: Biotecnología Vegetal
DOCENTE: María Fernanda Garces
NIVEL: Sexto Semestre
Estudiantes: Calapiña Serrano Cristhoper Fernando
Mejía Lugo Jaleny Ailin
Burgos Tagle Dayana Lisbeth
TEMA: Cultivos in vitro
FECHA DE ENTREGA: 15/05/2024
Introducción.
¿Que es In vitro?
In vitro del latín en vidrio, se refiere a una técnica para realizar un determinado
experimento en un tubo de ensayo, o en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo,
para el cultivo de múltiples microorganismos y organismos. (Castillo, 2014)
Se puede cultivar desde una bacteria hasta órganos complejos como hígados, o riñones para
trasplantes o investigaciones.
El cultivo in vitro es muy beneficioso ya que nos ofrece un medio contralado, en donde se
puede controlar todo tipo de factores como la temperatura, los nutrientes, humedad, entre otras
variables. (Orellana et. al, 2024)
Objetivo.
El objetivo de este trabajo es el análisis y la comparación de las variables y
componentes en distintos medios de cultivos de diferentes plantas, además se desea conocer las
posibles similitudes que pueden presentar en los medios de cultivos.
Desarrollo.
1. Fases del Cultivo In Vitro
El proceso de micropropagación se puede dividir en cinco etapas diferentes:
Fase 0 o “Selección y cultivo de plantas madre”
Esta etapa implica la propagación vegetativa de plantas que no presenten síntomas de
enfermedades con las características de interés, el nivel de cuidado requerido de las plantas se
consigue mejor en un invernadero, en el que se toman medidas preventivas contra plagas y
patógenos.
Fase I o “Establecimiento del cultivo”.
El propósito de esta etapa es iniciar cultivos axénicos. Implica la selección de explantes,
desinfección y cultivo en condiciones asépticas. Se inoculan en el medio de cultivo adecuado
para inducir la germinación o el crecimiento inicial. Durante esta fase, se utilizan hormonas para
promover la germinación y la formación de callos si es necesario.
Fase II o “Multiplicación”.
Las masas de tejidos se subcultivan repetidamente en condiciones asépticas en nuevos medios
de cultivo que fomentan la proliferación de propágulos. El cultivo puede suministrar brotes para
las siguientes fases de propagación, así como el material necesario para mantener el stock. Se
pueden realizar subcultivos cada 4-6 semanas para aumentar el número de plántulas
Fase III o “Enraizamiento”.
Esta etapa está diseñada para inducir alargamiento y desarrollo radicular transfiriendo el
explante a un medio de cultivo con una baja concentración de sales y citoquininas en conjunción
con un aumento de las auxinas exógenas para promover el enraizamiento, y puede durar tardar
de 2 a 4 semanas. Además, no todas las especies requieren una etapa de enraizamiento ya que
pueden generar raíces en el medio de multiplicación de forma simultánea. (Velasteguí, 2021)
(Roca & Mroginski, 1991).
Fase IV o “Aclimatación”.
Las plantas micropropagadas son vulnerables a la transferencia a condiciones ex vitro, por lo
que es necesario un acondicionamiento gradual al entorno. Esta fase es crítica, pues las
plántulas son susceptibles a la pérdida excesiva de agua, tienen un sistema fotosintético
deficiente y dependen inicialmente de las reservas de alimento almacenado. Inicialmente, se
mantienen en condiciones de alta humedad y baja luz para adaptarse gradualmente a
condiciones ambientales normales.
Las plántulas con raíces se trasladan a condiciones ex vitro en invernaderos o casas de sombra.
(Velasteguí, 2021) (Altman & Loberant, 2003; Roca & Mroginski, 1991).
2. Cultivo in vitro de la plántula de cacao (Theobroma cacao).
El cultivo in vitro de plántulas de cacao (Theobroma cacao) es una técnica avanzada que
permite la propagación y mejora de la planta bajo condiciones controladas.
2.1 Medio de Cultivo
El medio de cultivo es crucial para el éxito del cultivo in vitro. Uno de los medios más
utilizados para el cultivo de cacao es el medio MS (Murashige y Skoog), aunque puede ser
modificado según las necesidades específicas.
2.2 Formulación del Medio de Cultivo:
Para el cultivo de plántulas de cacao en especifico se usa el medio MS, pero se aplicó ciertas
modificaciones en las cantidades que sugiere el medio, para un mejor rendimiento y manejo de
recursos.
Para el caso en el que se investigó se usó hojas jóvenes de 10 cm o más de largo y 5 cm o más
de ancho y el color rojizo o verde pálido, de una edad aproximada de 3-7 semanas. Las hojas no
deben estar infestadas con insectos y no deben haber sufrido algún daño causado por insectos o
patógenos, previo a la desinfección de los explantes se eliminará 2 cm de la parte distal y
proximal de la hoja. Para la desinfección del material vegetativo se inició con un lavado con
agua y jabón, posteriormente se realizó una inmersión en alcohol al 70% por 10 segundos. A
continuación, se sumergió los explantes en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al
20% volumen/volumen (Ingrediente activo 4.72 %), 14 con 2 gotas/100 mL de Tween 80® por
20 minutos. Transcurridos los 20 minutos los explantes se llevaron a la cámara de flujo laminar,
donde se realizó un triple lavado con agua destilada estéril con el fin de remover el NaClO
residual.
Una vez desinfectadas las hojas se procedió a realizar cortes con la ayuda del bisturí a tal
manera que sean de un tamaño aproximadamente 1 cm × 1 cm, luego con la pinza estéril se
colocó los explantes en el medio de cultivo estéril con el envés de la hoja en contacto con el
medio, los explantes se colocaron uno por frasco en el centro del frasco. (Palacios, 2022)
Composición de el medio de cultivo MS. Obtenido de (Palacios, 2022)
Sales Basales:
- Nitrato de amonio (NH4NO3): 1650 mg/L - Nitrato de potasio (KNO3): 1900 mg/L
- Fosfato monopotásico (KH2PO4): 170 mg/ - Sulfato de magnesio (MgSO4·7H2O): 370
mg/L
- Calcio: 440 mg/L
Micronutrientes:
- Boro (H3BO3): 6.2 mg/L - Cobalto (CoCl2·6H2O): 0.025 mg/L
- Cobre (CuSO4·5H2O): 0.025 mg/L - Zinc (ZnSO4·7H2O): 8.6 mg/L
- Hierro (FeSO4·7H2O) y EDTA (Na2-EDTA): 36.7 mg/L
- Manganeso (MnSO4·H2O): 16.9 mg/L - Molibdeno (Na2MoO4·2H2O): 0.25 mg/L
Vitaminas
- Tiamina (B1): 0.1 mg/L - Piridoxina (B6): 0.1 mg/L
- Nicotinamida (B3): 0.5 mg/L - Mio-inositol: 100 mg/L
Carbohidratos:
- Sacarosa: 30 g/L - Agar: 8 g/L - Hormonas Vegetales:
- Ácido indolacético (IAA): 0.5 mg/L - Bencilaminopurina (BAP): 1.0 mg/L
3. Cultivo in vitro de Rosa hybrida L
Se recolectaron tallos de varios cultivares de Rosa hybrida L. de plantas
fenotípicamente sanas, ramas en crecimiento activo a partir de un año de cultivo en invernadero.
El material vegetal fue llevado inmediatamente al laboratorio para su procesamiento ya que la
empresa de la que se obtuvo estaba cerca del laboratorio, por otro lado, se obtuvo tallos
provenían de una zona lejos del laboratorio y se sumergieron en una solución fungicida 0.6 g/L
de Switch® (Syngenta), se envolvieron en papel periódico y transportaron a baja temperatura
para impedir la proliferación de microorganismos contaminantes y su desecación.
El medio de cultivo utilizado fue el Murashige & Skoog
En todas las fases, el medio MS se suplementó con sacarosa (30 g/L), agar (6 g/L) y reguladores
de crecimiento del tipo citoquininas (BA) y auxinas (IBA y ANA) a diferentes concentraciones
de acuerdo a la etapa de micropropagación. Adicionalmente, en las etapas de establecimiento y
multiplicación se agregó ácido cítrico (0.1 g/L) para evitar la oxidación por compuestos
fenólicos (Pati et al., 2006).
Previo a la adición del agar se ajustó el pH a 5.8 con KOH o H2SO4 (1 N). Se dispensó 37 10
mL del medio fundido en tubos de ensayo (25 x 15 mm) o 30 mL en frascos de vidro y
esterilizó en autoclave a 121 ºC, 1.06 kg/cm2 durante 15 minutos.
3.1 Composición del medio Murashige & Skoog.
Se incubó los explantes en un cuarto de crecimiento a una temperatura media de 25 ± 2 °C,
densidad lumínica de 28 ± 5 µmol/m2 /s de luz blanca de lámparas LED, con un fotoperiodo de
16 horas. Estas condiciones de cultivo se mantuvieron a lo largo de los experimentos.
Y se siguió la metodología ya descrita para la micropropagación de organismos. (Pati, et. al,
2005)
Bibliografía
Castillo, A. (22 de 04 de 2014). Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología
que nos acompaña hace mucho tiempo. Las Brujas, Canelones (Uruguay): INIA, 2004.:
http://www.ainfo.inia.uy/digital/bitstream/item/410/1/111219220807102417.pdf
Miguel Alejandro Orellana Carrión, D. C. (2024). El cultivo in vitro de plantas y su aporte en la
agricultura local. Esferas, 5, 13.
https://doi.org/https://doi.org/10.18272/esferas.v5i1.3137
Palacios, M. A. (07 de 2022). Establecimiento in vitro de Cacao (Theobroma cacao L.) híbrido
CCN-51 usando explantes foliares. Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano,
Departamento de Ciencia y Producción Agropecuariam, Ingeniería Agronómica:
https://bdigital.zamorano.edu/server/api/core/bitstreams/be8b31f5-edae-4c0e-a551-
16f3dc8d6150/content
Pati, P. K. (2005). In vitro propagation of rose. Biotechnology Advances, 24(1), 94–114.
https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2005.07.001
Velasteguí, X. A. (10 de 08 de 2021). Implementación de un protocolo de cultivo in vitro de
rosas de corte (Rosa hybrida L.) a partir de segmentos nodales para la propagación
masiva de plantas. Trabajo de titulación, previo a la obtención del título de Ingeniero
en Biotecnología: http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/26204/1/T-ESPE-
046536.pdf
