TEMA 9: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
Es uno de los campos más complejos y tediosos dentro de la enzimología. Es
necesario para determinar la estructura tridimensional de enzimas o determinar los
mecanismos de catálisis, así como obtener productos comerciales.
Es un proceso muy complejo puesto que la enzima está acompañada de otros
componentes excepto si es secretada por el organismo, por ejemplo, un gran número de
proteínas que se le asocien. Además, las enzimas interaccionan formando agregados con
otras biomoléculas. El desarrollo de técnicas de química preparativa solventa lo anterior a
partir del estudio de propiedades físico-químicas de las biomoléculas.
A la hora de extraer debemos elegir el material de partida como organismos, tejidos
o fracción subcelular dándose pérdidas de la enzima por lo que hay que elegir bien la fuente.
También tener en cuenta el modo de ruptura celular adecuado (no en enzimas secretadas)
dependiendo del tejido; disponer de un ensayo enzimático apropiado para seguir la
situación de la enzima que nos interesa; qué técnica cromatográfica se va a utilizar
(filtración, intercambio iónico o afinidad con el ligando) para separar moléculas según sus
propiedades; qué técnicas de solubilización se van a usar como la insolubilización por
precipitación por salado (c amónico) o con cambio de disolvente.
La eliminación de contaminantes con la filtración molecular o diálisis separando
cuando una enzima es relativamente pura. Disponer de un criterio de pureza para saber
cuál es el grado de esta que se necesita en cada caso. Es necesario aplicar varios pasos y
diferentes técnicas durante la purificación, viendo que con cada paso aumenta la actividad
enzimática específica pero no así la absoluta.
Ensayo enzimático en purificación
Este debe ser fácil de realizar antes que fiable o preciso, debe hacerse siempre en
las mismas condiciones para poder comparar, y el sustrato ha de ser el más económico y en
condiciones de saturación para que trabaje a velocidad máxima.
Elección de la fuente de la enzima
La actividad o cantidad varía entre organismos y dentro de ello varía en el tejido en
el cual debe estar lo más fresco posible y coger aquel donde la enzima sea más abundante.
La elección de una buena fuente facilita el proceso.
Localización
Tener claro cuál es la localización exacta de la enzima de interés siendo esto más
fácil en procariotas.
Enzimas en solución verdadera disueltas en citoplasma o medio extracelular por
exportación. Al retirar material el material particulado queda esta disolución.
Enzimas en estructuras como mitocondrias, núcleo, Golgi, etc.
o En solución verdadera.
o Asociadas a material lipoproteico del orgánulo.
RUPTURA DE CÉLULAS Y TEJIDOS
La obtención del homogenado consiste en extraer el material biológico que ha sido
triturado liberándose las proteínas.
1. Homogenización mecánica con Potter-Elvehjem, por homogeneizador de aspas o
por paletas. Muy utilizado en tejidos vegetales y animales.
2. Homogenización sónica: Ruptura por emisión de sonido y ultra-sonido provocando
la vibración que da lugar a cambios de presión (sonicadores). Pueden ser de sonda
o de baño usados con bacterias, levaduras, etc.
3. Homogenización por desintegración térmica: ciclos de congelación y descongelación
rápidos. Ultrcongeladores a -80˚C que rompen las células por formación de cristales.
El nitrógeno líquido a -195.8˚C también es utilizado. Útil con bacterias, eritrocitos y
cultivos celulares.
Naturaleza del medio de extracción y protección de la actividad
En enzimas intracelulares antes de romper las células se deben resuspender en un
medio de extracción que asegure la protección de la enzima. Una vez extraída la célula de
su medio natural hay que protegerla de los cambios de pH, temperaturas extremas o
actividad de las proteasas.
Para proteger la actividad de las enzimas:
Hay que controlar el pH usándose los buffers adecuados, es decir, con la correcta
fuerza iónica.
Se tiene que bajar la temperatura para disminuir la actividad de las proteasas.
Se adicionan agentes protectores que inhiban a las proteasas o protectores de
grupos funcionales.
Si están en membranas o estructuras se añaden detergentes que rompan las
interacciones y podamos encontrarlas independientes. El proceso de ruptura y purificación
tiene que ser lo más rápido posible debiendo hacerse en frío. Los homogenizados se meten
en macetas de hielo, así como las soluciones que se usaran; además podemos utilizar
cámaras frías (4˚C) que enfrían todo el ambiente.
Concentración y purificación de enzimas
Se realiza una centrifugación diferencial para fraccionar el homogenizado y separar
enzimas. Esto aumenta la concentración de enzima al estar retirando volumen inicial de
otras sustancias o estructuras de orgánulo. Cuando localizamos la fracción en el precipitado
será necesario aplicar detergentes para el purificado.
Técnicas más frecuentes de purificación
La cromatografía de capa fina es una técnica donde encontramos un silica gel
colocado sobre un cristal fino. Esta se basa en poner en un extremo lo que se va a separar,
se introduce el cristal en un solvente que forma la fase móvil que asciende por capilaridad
quedando los componentes en distintas posiciones. Estos se ven como manchas que se
pueden raspar para recuperar el material.
La cromatografía de columna consiste en introducir una mezcla en la parte superior
de la columna que tiene empacada en su interior esferas de materiales con distintas
propiedades físico-químicas. Las partes de la muestra pasan por todo el medio
interaccionando en mayor o menor medida con las esferas y separándose las partes de la
mezcla. Sale el líquido por la parte inferior de la columna que se fracciona a su vez en
mezclas mucho menos complejas. Dependiendo del tipo de empaque que presenten las
columnas se distinguen distintos tipos de cromatografía de columna:
Cromatografía de exclusión molecular o filtración de gel: Se empaca la columna con
material poroso. Todas las moléculas pequeñas pasan por los poros ralentizándose
en su bajada a la parte inferior, por lo que las grandes moléculas serán las que
encontremos el primer líquido que obtengamos por la rapidez con la que bajan.
Cromatografía de intercambio iónico: La característica del material que se empaca
es que puede interaccionar con moléculas de diferente carga que será lo último que
se obtenga en el líquido. Para separar las moléculas que interaccionan con las
esferas por tener carga opuesta se usa un contraión.
Cromatografía de afinidad: El empaque de la columna es con material unido a un
ligando de la enzima. Se usan efectores alostéricos, inhibidores competitivos,
análogos de sustratos de la enzima o anticuerpos.
CRITERIOS DE HOMOGENEIDAD Y PUREZA
Se realizan ensayos enzimáticos para ver si la actividad enzimática específica ha
aumentado. También se monitorea la purificación con otros parámetros como:
Rendimiento:
𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑖
𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑎𝑙
Grado de purificación:
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑖
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
Cuando la purificación alcanza la etapa posterior, las purificaciones no aumentan la
actividad enzimática específica, por lo que se investiga la homogeneidad de la muestra
mediante otros métodos que pueden ser analíticos como electroforesis, cromatografía
líquida o la focalización isoeléctrica.
