PROCESAMIENTO TISULAR MICROTOMIA

Y TECNICAS DE CORTE
INTRODUCCIÓN
-Fase del proceso tisular.
Microtomia
-Se obtiene el bloque confeccionado
-Secciones o cortes finos para poderlo observarlo al microscopio
óptico

blanca -Se coloca sobre el porta objetos.

-No se realiza procesos de tinción ni detección.

MICROTOMÍA

Microtomia -Equipo mecánico de precisión

-Realizar cortes en tejidos que se han hecho la
inclusión (congelado o sólido)
-Secciones delgadas permitir su examen y
visualización al microscopio.
TIPOS DE MICRÓTOMOS
- El principio de acción es el mismo

Micrótomos -Buena iluminación

-No estar localizados en zonas de paso
-La poita ha de ser de obra para evitar vibraciones
Existen 6 tipos de micrótomos:
1. Oscilatorio o de balanceo 2. Micrótomo de rotación o tipo Minot
3. Micrótomo de deslizamiento 4. Micrótomo de congelación
5. Criostato o Criotomo 6. Ultramicrótom
Micrótomo de rotación o tipo Minot (1885)
-Cuchillas de corte → Acero inoxidable de 1 o varios usos Biplanas o en cuña
-Grosor de las secciones → 4 a 7 micras
-Obtención de las secciones en tiras
-Recogida de Secciones :
o Planchado en agua destilada a 37 – 42º en baño termostático
o Recogida en la superficie de agua destilada sobre portaobjetos

Micrótomo de deslizamiento (Ranvier)

-Con el micrótomo de deslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de
deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa.
-En estos micrótomos el movimiento lo proporciona la mano y es de ida y vuelta.
-Bloques a partir de medios de inclusión de Celoidina , Gelatina, agar
-Cuchillas bicóncavas o planocóncavas
-Grosor de las secciones 100-200 micras
- Obtención de muestras individuales
-Tipo Leith ( portabloques deslizante)
-Tipo Reichert-Jung ( cuchilla móvil)

Micrótomo de Congelación
-El micrótomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de grosor.
- Consiste en una plataforma que se enfría a bajas temperaturas sobre la que se coloca
la muestra.
-Tras cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte
seleccionado.
-Antiguamente la congelación se hacia mediante gas carbónico que había que
suministrar regularmente.
-Actualmente se produce la congelación (de -30°C a -40 °C) de la plataforma mediante
tubos.
-Existe la posibilidad de congelar también la cuchilla si se desea.
-En los aparatos actuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma
y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte.
X Mecanismo de avance mecánico o automático
-Las secciones que se obtienen, se recogen con un pincel, se añaden a un recipiente
con tampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación.
- Actualmente no uso rutinario
Criostato o Criotomo.
-El criostato se utiliza para obtener secciones por congelación de 10 a 30 µm de grosor,
aproximadamente.
-En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en una cámara
refrigerada cuya temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C.
- La congelación se hace en una plataforma dentro de la propia cámara refrigerada que
se encuentra a una temperatura inferior, en torno a -50 °C.
- Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con
superficies adhesivas.
-Las secciones se descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que los
portaobjetos están a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para
las técnicas que deseemos.
-Ventaja frente a micrótomo de congelación Ya que permite cortes mas finos
( 4micras)
-Usado en AP para estudios histoenzimáticos
-Inmunohistoquímicos sobre tejido congelado
Ultramicrotomo.
-Para la observación con detalle de la ultraestructura celular es necesario realizar
secciones muy delgadas, del orden de nanómetros, denominadas ultra finas, y
observarlas con el microscopio electrónico de transmisión.
-El Ultramicrótom tiene un diseño para cortar de un modo similar al micrótomo de
rotación Minot, pero mucho más preciso y sofisticado. (sistema más delicado hace
avanzar el bloque sobre la cuchilla pues a intervalos de varios nanómetros).
- Corte de bloques medio de inclusión no hidrosolubles : Resinas sintéticas ( Araldit,
Espurs , Epoxy)
-Corte de bloques medio de inclusión no hidrosoluble: Metacrilato
-Portacuchillas regulable ( Cuchillas de Vidrio o Diamante)
TIPOS DE CUCHILLA bicóncava -Bloques de parafina en micrótomo de
balanceo o rotación

Planocóncavas
-Tipo A (parafina)
-Tipo B (celoidina)

Biplana en
cuña parafina en micrótomo

-
Biplana con faceta

Micrótomo de congelación o tejidos muy duros

AFILADOR DE CUCHILLAS
-Manual o Automático
-Superficies de afilado manual :
o Piedra amarilla de Bélgica
o Sintéticas: Carborundo
o Pasta de vidrio con oxido de aluminio

-Dispositivos automáticos
-Angulo de bisel según la necesidad del corte (15-80⁰)

Proceso afilado
- Afilado: Eliminar las partes dañadas del filo.
- Desbastado: Eliminar irregularidades ( piedras de
grano fino)
-Suavizado: Perfeccionado de filo ( Cuero con
grasa especial)
 Tras finalizar el afilado hay que ajustar el ángulo del bisel.
 Preservar el filo de las cuchillas
-Debastado de los bloques: Eliminar las
mayor tiempo posible
capas del medio de inclusión hasta alcanzar
la superficie del tejido.
o Realizarlo con otra cuchilla o con los
bordes (preservar zona para corte)
o No debastar bloques con cortes
mayores a 20-25micras
- Para el buen uso de la cuchilla:
o Mantenerlas guardadas en su caja
o Suavizado diario antes de usarlas
o Limpiar el borde con Xileno antes y
después de usarlas
o Impregnarlas con aceite especial
conservante para almacenaje
prolongado
o No prestar las cuchillas ( Técnica de
corte es personal)
TECNICAS DE CORTE SOBRE BLOQUES DE PARAFINA
-Obtención de secciones de calidad y espesor adecuado

1. Micrótomo moderno y mantenimiento

adecuado
3 condiciones para
garantizar el proceso: 2. Cuchilla de micrótomo correctamente
afilada
3. Formación y experiencia

1. Retallado y enfriamiento del bloque

Pasos para la 2. Fijación al portabloques
confección de los
cortes en parafina: 3. Orientación del bloque
4. Orientación de la cuchilla del micrótomo
5. Selección del espesor del corte
6. Realización de las secciones
PASOS PARA LA CONFECCIÓN DE LOS CORTES EN PARAFINA:
1. Retallado y enfriamiento del bloque
o Eliminar el exceso de medio de inclusión
o Aumenta la superficie total de contacto con la cuchilla
o Que durante el corte la resistencia que opone el bloque solamente sea la
que realiza el tejido incluido y no a la del exceso de parafina.
o Enfriamiento previo del bloque buscando consistencia optima
o Temperatura optima de parafina para su corte ( 5 a 10⁰C)
o Temperatura de almacenamiento optimo 4⁰C
o Nunca colocar los bloques a 0⁰C (artefactos y cristalización de tejidos!!!)
2. Fijación al portabloques:
Sistemas comerciales con soportes de forma paralepipedica adaptables a
portabloques.
3. Orientación del bloque:
o Una vez colocado el bloque en portabloques se hace descender el brazo del
micrótomo hasta que entre en contacto con la cara interna de la cuchilla de
debastado.
o Comprobar exacto paralelismo entre ambas si no lo hay ajustarlo.
4. Orientación de la cuchilla:
o Para orientar correctamente la cuchilla de un micrótomo hay que tener en
cuenta que existen 4 ángulos de control de la incidencia del bloque sobre la
cuchilla:
1. Ángulo de inclinación (I)
2. Ángulo de arastre (A)
3. Ángulo de corte (C)
4. Ángulo libre (L).

o Una vez orientada la cuchilla se procede a debastado hasta obtener en cada

corte la superficie completa del tejido. (colocar micrótomo a 25-30 micras)

5. Selección del grosor de los cortes :

o Espesor 4 a 6 micras
o Cortes mas finos son dificultosos pero útiles en patología renal , linfoide y
Hematopoyética
o Cortes mas gruesos 10-20 micras estudio de tejido nervioso central.
o El tejido incluido en parafina no puede ser cortado a mas de 20 micras de
espesor ( enrollamiento de los cortes)
o Si requieren cortes >20 micras inclusión de material en celoidina
 6. Realización de las Secciones:
o Sustituir la cuchilla de debastado x la de corte o movilizar la existente
o Movimiento rítmico del volante que moviliza el brazo del micrótomo →
cinta continua de cortes ( blancas)
o La velocidad de corte es inversamente proporcional a su dureza
o Fijar la cinta con pincel o pinzas → Evitar su fraccionamiento
o Si tejido muy friable se ayudar exhalar el vaho de la respiración sobre el
bloque.
7. Estirado de los cortes y confección de las preparaciones:
o Escoger la cinta de mayor calidad y estirar en baño de agua caliente
o Baño a Tº 45 – 50⁰C
o Fenómeno de flotación x fuerzas de tensión superficial
o Eliminar arrugas sobre los cortes con delicada manipulación
-Pinceles de pelo fino o agujas de histología
o Capturar los cortes con el portaobjetos ( Reflotación y orientación)
o Una vez terminado eliminar por completo los restos nadantes en el agua
(papel de filtro)
8. Secado de las preparaciones Histológicas:
o Después del montaje en el portaobjetos→ Secado meticuloso
o Evitar su desprendimiento → desecación
o Estufa a 60º durante 10 a 20 minutos
-Preferiblemente en estufa a 37º hasta el día siguiente
-Técnicas de altas temperaturas 100º están proscritas ( daño irreversible
sobre los componentes bioquímicos y antígenos tisulares)
o Los mayores problemas que plantea la obtención de secciones en el
micrótomo de rotación derivan de una inadecuada orientación de la
cuchilla.
PROBLEMAS MAS COMUNES EN EL CORTE DE TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA:

Problemas
Cuchilla excesivamente perpendicular al bloque :
 Angulo de inclinación >15º y por tanto
ángulo libre >8º y de corte a 60º.
 Arranca la parafina y se producen fuertes
ondulaciones x vibración de la cuchilla
Cuchilla excesivamente paralela al bloque :
 Ángulo de inclinación < 10º, el ángulo libre
es negativo y el corte menor de 60º ,la
faceta inferior de corte se desliza sobre él.
 No es posible obtener una sección hasta
que el bloque ha avanzado lo suficiente
 como para salvar la faceta de corte de la
cuchilla.
 Obtención de cortes discontinuos de gran
espesor.
TECNICAS DE CORTE MATERIAL INCLUIDO CELOIDINA

o Los bloques de celoidina no conservan sus propiedades de consistencia y

ductilidad en el ambiente habitual del laboratorio.
o Para su conservación y grado óptimo de dureza es necesario mantenerlos inmersos
en alcohol etílico al 70%, lo que hace engorroso su manejo
o Antes de fijarlos sobre el micrótomo han de ser pegados sobre un portabloques de
madera o vulcanita (roca volcánica porosa).
o No es posible emplear para su confección las estaciones convencionales con
casetes como portabloques estándar

• Cubrir la superficie del portabloques con

una cantidad adecuada de celoidina al 8%
• Colocar sobre ella el bloque
correctamente orientado, manteniendo
durante unos minutos la presión.
Montaje del
bloque • Secar al aire y colocar al menos 30
minutos más en etanol de 70º para
conseguir un adecuado endurecimiento.
• Es conveniente el retallado del bloque
exceso de medio de inclusión en su
periferia; sin embargo, no es necesario
realizar un enfriamiento previo al corte

Características
El tejido incluido en celoidina→ secciones
del micrótmo
en un micrótomo de deslizamiento tipo
Leitz.
 • Se consideran los mismos ángulos de
influencia sobre el plano de corte que en el
Orientación cuchillas Minot.
• La variación de mayor trascendencia
afecta exclusivamente al ángulo de
inclinación de la cuchilla, formado por la
cara inferior de ésta y la superficie del
bloque. (Cuchilla plano-concava
• En este caso el ángulo pasa de oscilar
inferior a 15º, por lo que el ángulo libre
decrece hasta situarse entre 0 y 5º.
• La cuchilla suele estar dispuesta
oblicuamente en el eje transversal del
bloque
Obtención y manipulación de los cortes
o Es imprescindible pincelar con etanol al 70% de forma continua tanto la cuchilla, la
superficie del bloque, e incluso los propios cortes obtenidos →Evitar su natural
tendencia a enrollarse, facilitar su estiramiento y contribuir a mantener la más
adecuada consistencia del bloque
o Los cortes se obtienen de uno en uno haciendo incidir el portabloques móvil sobre
la cuchilla a través de su deslizamiento sobre las guías del micrótomo.
o Se estiran directamente con el pincel mojado en etanol de 70º sobre la superficie
de la cuchilla, donde quedan retenidos.
o Flotación en baño de Alcohol al 70% y se reservan
o La coloración se realiza x flotación previa a montaje o en el bloque antes de cortar

TECNICAS DE CORTE MATERIAL CONGELADO

o La obtención de secciones histológicas a partir de material congelado es de sumo
interés en biopsias intraoperatorias (la base del tratamiento quirúrgico en
Oncología).
o Se ha desplazado la responsabilidad de las decisiones desde el cirujano hacia el
patólogo.
o Es imprescindible garantizar un diagnóstico en congelación que resulte
prácticamente definitivo
o Poseer una técnica adecuada de biopsia con secciones de una calidad equivalente a
las de parafin
o Diagnóstico morfológico → Empleo de técnicas histoenzimáticas e
inmunohistoquímicas para determinar tanto antígenos de superficie como
actividad funcional.
o Estas técnicas requieren una preservación absoluta de la estructura de las
proteínas y del fenotipo célula.
o En teoría→ secciones histológicas sobre material fijado por congelación se pueden
realizar con el micrótomo de congelación clásico (de gas carbónico
TECNICAS DE CORTE MATERIAL CONGELADO CLASSICO
o En la práctica→ desplazado por el criostato o criotomo ( gran delgadez de los
cortes y mayor sencillez de su manejo.)
o Conocer la técnica de corte con el micrótomo de gas carbónico puede ser útil en
caso de avería del criostato y:
-Para obtener secciones gruesas (superiores a 20μ) necesarias en histoquímica del
sistema nervioso, se hace imprescindible poder seguir el recorrido de las
prolongaciones neuronales el mayor trayecto posible.
o Congelación del bloque por enfriamiento de portabloques:
-Enfriamiento progresivo de la superficie
-Usar papel de filtro humedecido ( tejido/superficie)
o Obtención de Secciones: Cortes espesor máximo 10micras
-Si muy congelado astillamiento
-Si tejido poco congelado machacamiento

Confección de • Recordar que se realizan cortes

preparaciones individuales
• Recolección directa de la superficie de la cuchilla
con pincel
• Flotación en baño de agua fría
• Recuperación del baño de agua fría en
portaobjetos
TECNICA DE CORTE EN CRIOSTATO
o CRIOSTATO → Micrótomo de rotación situado en interior de cámara de
congelación
o Secciones de hasta 2 micras ( habitual 4 – 6 micras)
o Técnicas histoenzimologicas o inmunoquímicas
o Material No fijado y Congelación rápida
o Evitar formación de cristales intratisulares
o Sistema de congelación ultrarrápido (placa y contenedor de isopentano a -50ºC)
o En su defecto Isopentano enfriado en nitrógeno liquido
o Pasar a la cámara de Criotomo para corte a -20ºC
o Una vez congelado realizar los cortes y recolección directa al portaobjetos.
o Dispositivo antienrollamiento ( dificulta la recolección)

Usar O.C.T
Facilitar los cortes:
  Medio sintético
 Alcohol+Polietinglicol

SOLUCIONES ADHERTENTES PARA PORTAOBJETOS
o Tamaño de portaobjetos standard → 7,6 x 2.5cm y 1 – 1,2 mm espesor
o Actualidad portaobjetos con zona marginal vidrio deslustrado
o Impregnar los portaobjetos para mantener adhesión de cortes
o Albumina y Gelatinas
o Nuevas sustancias Resinas ( Araldita , Poli – L – Lisina)
o Se utilizan entre el corte histológico y el portaobjetos, tiene como finalidad
asegurar la permanencia e integridad del corte histológico obtenido, permitir
realizar los procedimientos posteriores sin producir el desprendimiento de la
muestra.
o Adhesivo mas clásico y económico ( clara
de huevo)
Albumina o Elección en técnica convencionales que
requieren adhesión mas fuerte(HQ) →
Excepción de impregnaciones argénticas
o Incompatible con Avidina- Biotina.

Reactivos -Clara de huevo recién extraida 50ml

-Glicerol 50ml
-Salicilato sódico 1gr

-Modo de operar
- Mezclar en agitador magnético y filtrar
Modo de operar alcohol-clorhídrico
-Impregnar portaobjetos con una fina película de l
a solución albuminada
-Secar al aire y calentar a 60ºC para coagular
proteína

Gelatina -Sustituye a albumina en técnica de impregnación

argéntica
Solución gelatina-alumbre de SOLUCION A:
cromo Gelatina molida 4,5grs Agua destilada 1000ml
Calentar progresivamente hasta 75° en agitación
continua, una vez completa la disolución bajar
temperatura a 50

SOLUCION B
• Alumbre de cromo al 4% 38,5 ml
• Ftalato de dibutilo 1 ml
• Merthiolate 0,1 g
Solución gelatina-alumbre de cromo
PROCEDIMIENTO:
-Sumergir los portaobjetos en la solución con el fin de que se forme una delgada
película.
-Dejar escurrir.
- Colocar a secar en la estufa a 37°c.
RESINAS Y OTROS ADHESIVOS
- Resinas acrílicas ( Araldina)
-Epoxiresinas
-Máxima adhesión pero difícil manejo
- Solución de resina en acetona 1:10
- La Poli – L – Resina es la base de todos los portaobjetos comercializados con adhesivo
incorporado
- Elección en técnicas de inmunohistoquímica , BM
TECNICAS DE CORTE Y MANEJO DE SECCIONES EN MICROSCOPIA ELECTRONICA
o Cortes de M.E → Nanómetros ( 1 nm = 10⁻⁶ mm)
o Baja capacidad de penetrancia de haz electrónico
o Cortes habituales <1micra ( 30 – 120nm)

Cuchillas del Ultramicrótom: -Fundamentales para el éxito

-De su estado depende enteramente la
calidad de corte
 Cuchillas de Vidrio -Inconveniente su fácil deterioro
( uso habitual) - Filo limitado a un cierto numero de cortes
-40-50cm long x 4-5cm ancho x 0,4-0,5cm
altura
-Bajo costo y desechable

o Fabricación a mano
o Fabricación instrumentada → Corta la barra formando prismas de cristal con
filo → Angulo de corte 45º
o La calidad del filo se controla con el microscopio
o Limpieza de bordes con Acetona concentrada

Cuchilla de diamante
• Son multiuso
• Mas costosas
• Afilado por pulimentacion → borde mas
imperfecto
• Empleo en corte de tejidos duros
( calcificados)
TECNICAS DE CORTE EN ULTRAMICROTOMIA
1. Emplazamiento del micrótomo
o Lugar aislado y con temperatura constante
o Protección de corrientes de aire
o Superficie antivibratoria y protección por mampara

2. Preparación del Bloque

o Tallado en forma de pirámide Truncada ( equivalente al debastado de parafina)
o Superficie de tallado amplitud máxima ( evitar la vibración)
• 1mm² en metacrilato
• 0.5 mm² en resina epon
o Si cuchilla y superficie de corte adecuada pero corte vibrado
o revisar velocidad del brazo ( disminuir al máximo)

3. Preparacion y Orientacion de la cuchilla

o Colocar baño de flotación para recoger los cortes (Agua destilada)
-Cinta adhesiva (cinta plateada impermeable)
 -Balsas desechables
o Orientación de la cuchilla
- Resina Epon ( 3 – 5º)
-Liquido flotación balsa → Agua acetonada 5-10% ( resina epon o araldita)
o Metacrilato mayor ángulo de corte lo que hace mas fácil cortar
-Liquido de flotación balsa→ Cloruro de bario 0.5M (prevenir sobrehidratación)
Obtención de cortes semifinos:
o Denominados cortes de control
o Utilidad en la selección de zona a observar en corte ultrafino
o Sección de 0.5 a 1micra de espesor
o Tinción standard de M.O → generalmente Azul de toluidina
o 0.5g de Azul de toluidina + 100 ml agua destilada con borato sódico 1%
o Se añade unas gotas al corte realizado
o Secar sin llegar a punto de ebullición

Obtención de cortes semifinos: Azul de toluidina

- 0.5g de Azul de toluidina + 100 ml agua destilada con borato sódico 1%
o Secciones ultrafinas grosor 30 – 90nm ( promedio 80nm)
o Selección de los cortes por sistema basado en fenómeno especifico: observar el
color de interferencia de la luz reflejada por el mismo corte mientras flota en
el agua
o Ángulo de incidencia de la luz sobre el tejido 45º y lampara de hendidura.
o Liquido flotador no iluminado directamente ( fondo oscuro)

La velocidad de corte óptima depende de:

 Tipo de Ultramicrótom
 Tipo y dureza del plástico
 la muestra
 Tipo y calidad de la cuchilla.
o Los plásticos pueden cortarse a velocidades relativamente altas (alrededor de 5
mm/s)
o Las resinas epóxi y los poliésteres se realizan con velocidades medias (entre 1 y 2
mm/s)
Extensión de los Cortes:
o Depende del medio utilizado ( Metacrilato Vs Epoxirresina)
o Cortes de Metacrilato→
-Papel de filtro impregnado con liquido volátil de baja tensión superficial
( benceno o cloroformo)
-Los vapores sobre el corte hacen que se extienda bruscamente
o Cortes de Epoxirresina →
-Habilidad del Técnico → Microinstrumentos ( Técnica similar a la parafina)
Montaje de los Cortes:
o Rejilla con baño electroquímico metálico ( tamaño 3x 2.3mm)
o Las rejillas se construyen de diferentes materiales •
-Cobre→ Observación simple
-Oro, níquel, carbón, platino → Citoquímica
-Se suelen guardar o transportar en placas o cajas especiales (porta
rejillas).
-Hilos de cobre de 50 micras con espacios de 150micras