​UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

QUÍMICA

Laboratorio de Fisicoquímica V

1601 B

Práctica 7

DESCOMPOSICIÓN DE UREA POR UREASA

Equipo:

Cuellar Leyva Wendy Rosalba

Lepe Spezzia Adolfo Armando

Rivera Ramírez Carlos

Profesor: Carlos Montaño Osorio

Introducción

En esta práctica se estudiará la descomposición enzimática de la urea por la enzima ureasa extraída del frijol de
soya y estudiaremos el avance de la reacción por medidas de conductividad gracias a la generación de iones
bicarbonato, hidróxido y amonio.

En el caso de las reacciones enzimáticas tenemos un perfil de máxima rapidez en la que la temperatura dada es
denominada temperatura óptima. Sobrepasando esta temperatura se da lo que se llama “desnaturalización”
de las enzimas debido a su origen proteico. En el intervalo anterior al de la temperatura óptima se ajustan
las reacciones biocatalizadas a la ecuación de Arrhenius:

k = Ae −Ea/RT

Tenemos un mecanismo de reacción para este caso, donde se involucra una especie intermedia, denominada
“ES” para su mejor comprensión en esta práctica. Este mecanismo propuesto por Michaelis y Menten es el
siguiente:

Esquema No. 1

IN) Co Co

rxn) x x

t) Co-x Co-x (x-x) 2x x x

La ecuación cinética a la cual se ajusta este modelo es el adaptado por Briggs y Haldane, a partir de un estado
estacionario para el complejo enzima-sustrato

r max [S ] 0
r0= K M + [S ] 0

Objetivos

▪ Investigar la cinética de descomposición de urea por ureasa

▪ Utilizar a la enzima ureasa extraída de soya

▪ Estudiar el mecanismo de reacción para reacciones biocatalíticas

▪ Obtener los parámetros cinéticos: constante de Michaelis (Km) y rapidez máxima (rmáx) mediante la ecuación
de Lineweaver-Burk.

▪ Seguir el avance de reacción por medidas de conductividad

▪ Investigar el efecto de la temperatura sobre la rapidez de reacción en la catálisis enzimática.

▪ Obtener la temperatura de máxima actividad de un biocatalizador (ureasa)

▪ Determinar la energía de activación de una reacción.

▪ Calcular energía interna, entalpía, entropía y energía de Gibbs de activación (ΔU≠, ΔH≠, ΔS≠ y ΔG≠) de
hidrólisis biocatalítica de la urea.

Experimentación

● Reactivos, instrumentos y materiales

Tabla No.1 Reactivos, Instrumentos y Materiales

Material Instrumentos Reactivos

Por equipo Por equipo Por equipo

-5 barras de agitación magnética -15 mL de disoluciones stock de
-5 tubos de ensaye de 20x200 mm -1 parrilla de calentamiento con urea 0.2 M, para preparar:
-1 vaso de precipitados de 100 agitación magnética -100 mL de solución de urea 0.02
mL. M
-1 pipeta volumétrica de 20mL -1 Puente de conductividad digital -20 mL de solución de urea 0.016
-2 perillas con celda. M.
-1 soporte universal -20 mL de solución de urea 0.012
-1 pinzas para matraz M.
-1 cronómetro -20 mL de solución de urea 0.008
-1 jeringa para insulina M.
-1 matraz volumétrico de 100 mL -20 mL de solución de urea 0.004
-4 matraces volumétricos de 25 M.
mL
-1 vaso de precipitados de 600 mL -6 mL de etanol

-1 g de frijol de soya

Por grupo
-1 centrífuga
-1 mortero con pistilo
-2 Tubos para centrífuga

Se llevó el seguimiento de la reacción de descomposición enzimática por medio de mediciones de la

conductividad con respecto al tiempo a diferentes temperaturas, con una concentración de sustrato inicial de
[S]= 0.002 M constante, los datos obtenidos se observan en la tabla no. 2

Tabla No. Conductividad con respecto al tiempo a 30,40,50 y 60°C

Tiempo 30°C 40 ​°​C 50 ​°C 60 ​°C

[seg]

30 140.1 148.8 201.8 245.2

40 148.6 159.2 226.2 268.2

50 155.8 168 246 296

60 160.2 176 269.4 322

70 169.0 182.6 291.2 352.8

80 174.0 189.8 315.6 398

90 179.8 196 337.8 412

 100 185.0 202.8 355.6 420

110 190.4 210 375.8 442

120 195.4 216.4 406.2 470

De esta misma forma se hizo el seguimiento mediante mediciones de conductividad con respecto al tiempo, pero
esta vez a diferentes valores de concentración inicial de sustrato, manteniendo constante la temperatura igual a
T=50°C o 323.15 K. Los valores obtenidos se registran el tabla no. 3

​Tabla No 3. Conductividad con respecto al tiempo a diferentes concentraciones de sustrato y 323.15 K

Tiempo 0.004 M 0.008 M 0.012 M 0.016 M 0.02 M 0.05 M
[seg]

30 132.6 168.8 185.6 195 201.8 212.6

40 148.8 189 208 218.8 226.2 238.6

50 163 207 229.8 239.6 246 262

60 177.2 225 249.6 260.4 269.4 285.2

70 191.2 242.8 267.8 281 291.2 307.8

80 207.2 263.2 291.4 304.6 315.6 333.6

90 221.2 281 309.6 325.2 337.8 356.2

100 233.8 297 327.8 343.6 355.6 376.4

110 246.8 313.4 246 362.8 375.8 397.4

120 265 333.6 372.4 386.4 406.2 420.2

Para determinar el valor de la r0 se hizo uso de un método gráfico con los valores de conductividad con respecto
al tiempo a temperatura constante, en la figura no. 1 se observan los valores obtenidos

Figura No. 1 Gráfico de conductividad con respecto al tiempo a diferentes concentraciones de sustrato.
Después del respectivo tratamiento de los datos obtenidos en la gráfica anterior el valor de r0 para cada
concentración de sustrato se muestra en la siguiente tabla no. 4

Tabla No. 4 Valor de rapidez inicial para cada concentración inicial de sustrato.

[S] r0

0.004 M 1.4671

0.008 M 1.86

0.012 M 2.06

0.016 M 2.1557

0.02 M 2.2571

0.05 M 2.3807

Con los valores de la tabla anterior se realiza el gráfico de rapidez inicial con respecto a la concentración de
sustrato para obtener los parámetros de la constante de Michaelis y la velocidad máxima.

Figura No. 2. Gráfica de rapidez inicial con respecto a la concentración inicial de sustrato

Observando que la velocidad máxima se encuentra a una concentración de sustrato 0.05M observando una
Vmax de 2.4 podemos determinar la constante de Michaelis a partir de la ecuación de Michaelis-Menten

v max V max [S]0 (2.4)(0.05)

r0 = Km
[S]0 ⇒ km = r0
= 2.3807
= 0.05040

Ahora se hará el tratamiento de los datos mediante las ecuaciones de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Hanes
para comparar sus resultados con los obtenidos anteriormente, esto con el fin de tomar el valor al que se ajuste
de mejor manera.

Retomando los valores de r0 y [S]0 y haciendoles el tratamiento adecuado obtenemos los resultados siguientes
Tabla No. 5. Tratamiento de concentración y rapidez inicial para el modelo de Lineweaver-Burk

[S] r0 1/[S] 1/r0

0.004 M 1.4671 250 0.681616795

0.008 M 1.86 125 0.537634409

0.012 M 2.06 83.333333 0.485436893

0.016 M 2.1557 62.5 0.463886441

0.02 M 2.2571 50 0.443046387

0.05 M 2.3807 20 0.420044525

Para los que se realizó el gráfico pertinente con respecto a la linealización de la ecuación de Lineweaver-Burk

1 Km 1 1
r0
= V max [S]0
+ V max

Figura No. 3. Gráfica del inverso de la rapidez inicial con respecto al inverso de la concentración inicial (linealización de Lineweaver-Burk)

1 1
Obteniendo un valor de intercepto de 0.3911 que también corresponde a b = V max
⇒ V max = 0.3911
= 2.5569 y
Km
un valor de pendiente correspondiente a 0.0012 que es igual a m = V max
⇒ K m = 0.0012(2.5569) = 0.0030

Retomamos nuevamente los valores de r0 y [S]0 para hacerles el tratamiento adecuado con respecto a la
ecuación de Eadie-Hofstee

Tabla No. 6. Tratamiento de los datos de rapidez y concentración de sustrato inicial para el modelo de Eadie-Hofstee

[S] r0 r0/[S]

0.004 M 1.4671 366.775

0.008 M 1.86 232.5

0.012 M 2.06 171.66666

0.016 M 2.1557 134.73125

 0.02 M 2.2571 112.855

0.05 M 2.3807 47.614

r
Realizando el gráfico con base a la ecuación r0 = V max − K m [S]0
0

Figura No. 4. Gráfico de la rapidez inicial con respecto a la diferencia entre la rapidez y la concentración (linealización de Eadie-Hofstee)

Obteniendo un valor de intercepto y pendiente de 2.5528 y 0.0029 respectivamente que corresponden

directamente al valor de V max = 2.5528 y K m = 0.0029

Por último retomamos nuevamente los valores de r0 y [S]0 para darles el tratamiento correspondiente a la
ecuación de Hanes

Tabla No. 7. Tratamiento de los datos de rapidez y concentración inicial para el modelo de Hanes-Wolf

[S] r0 [S]/r0

0.004 M 1.4671 0.00272647

0.008 M 1.86 0.00430108

0.012 M 2.06 0.00582524

0.016 M 2.1557 0.00742218

0.02 M 2.2571 0.00886093

0.05 M 2.3807 0.02100223

[S]0 Km 1
Elaborando el gráfico de acuerdo a la ecuación r0
= V mx
+ V max
[S]0
Figura No. 5. Gráfica de la diferencia entre la concentración y la rapidez con respecto a la concentración (linealización de Hanes-Wolf)

1 1
Arrojando un valor de pendiente de 0.3976 el cual corresponde a m = V max
⇒ V max = 0.3976
= 2.5150 y un valor
Km
de intercepto igual a 0.0011 que corresponde a b = V max
= K m = 2.5150(0.0011) = 0.002766

Comparando todos los valores de los parámetros obtenidos, observamos

Tabla No. 8. Valores de los parámetros cinéticos de los tres modelos de linealización

Gráfico Km Vmax

Lineweaver-Burk 0.0030 2.5569

Eadie-Hofstee 0.0029 2.5528

Hanes-Wolf 0.002766 2.5150

La Vmax es el único parámetro que depende del valor de [E] por tanto si se reduce a la mitad o se duplica el
doble, lo mismo pasará con el valor de la Vmax ya que es directamente proporcional.

Para obtener los valores de rapidez inicial del primer experimento, se hace uso de un método gráfico en el que se
grafica la conductividad con respecto al tiempo a cada temperatura. Los datos se muestran en la siguiente figura
Figura No. 6. Gráfica de Conductividad con respecto al tiempo a diferentes temperaturas

Haciendo el tratamiento de los datos obtenidos, el valor de la rapidez inicial a cada temperatura se coloca en la
tabla siguiente

Tabla No. 9. Valor de rapidez inicial para cada temperatura

TK r0

303.15 0.6061

313.15 0.7304

323.15 2.2208

333.15 2.5303

Se realiza un gráfico de rapidez inicial con respecto al tiempo para determinar la temperatura óptima, se muestra
en la siguiente figura.

Figura No. 7 Gráfica de rapidez inicial con respecto a la temperatura.

Del gráfico anterior se concluye que la temperatura óptima puede ser 333.15 K ya que no es perceptible una
disminución de la actividad catalítica hasta esa temperatura. La velocidad sigue aumentando hasta dicha
medición.

Retomando los valores de la tabla 9 ya haciendo la consideración de la rapidez inicial como la constante de
rapidez, podemos determinar los parámetros de energía de activación y factor de frecuencia haciendo uso de la
ecuación de Arrhenius

Tabla No. 10. Tratamiento de los datos para la ecuación de Arrhenius.

TK r0 lnr0 1/T

303.15 0.6061 -0.50071029 0.00329869

313.15 0.7304 -0.31416295 0.00319335

323.15 2.2208 0.79786749 0.00309453

333.15 2.5303 0.92833787 0.00300165

Ea 1
Así mediante este ecuación lnk = lnA − R T
se obtiene el siguiente gráfico.

Figura No. 8. Determinación de los parámetros cinéticos de Arrhenius.

Arrojando un valor de intercepto igual a 17.386 el cual corresponde a b = ln A ⇒ A = e17.386 = 3.55x107 y un

valor de pendiente igual a 5452 que corresponde a m = Ea
R
⇒ E a = 5452(8.314) = 45.327 KJ/mol

Con los parámetros de Arrhenius se pueden obtener los parámetros de activación para cada temperatura
haciendo uso de la ecuación de Eyring de la siguiente manera

ΔH =/ = E a − RT = 45327J/mol − 8.317J/Kmol(303.15K) = 42.806KJ/mol

ΔH =/ = E a − RT = 45327J/mol − 8.317J/Kmol(313.15K) = 42.723KJ/mol

ΔH =/ = E a − RT = 45327J/mol − 8.317J/Kmol(323.15K) = 42.640KJ/mol

ΔH =/ = E a − RT = 45327J/mol − 8.317J/Kmol(333.15K) = 42.557KJ/mol

 −1 −1 −34
(3.55x107 M s )(6.626x10 Js)
ΔS =/ = ln( 1 −23 (8.314J/molK) =− 108.81J/molK
e (1.38x10 J/K)(303.15K)

−1 −1 −34
(3.55x107 M s )(6.626x10 Js)
ΔS =/ = ln( 1 −23 (8.314J/molK) =− 109.0893J/molK
e (1.38x10 J/K)(313.15K)

−1 −1 −34
(3.55x107 M s )(6.626x10 Js)
ΔS =/ = ln( 1 −23 (8.314J/molK) =− 109.3506J/molK
e (1.38x10 J/K)(323.15K)

−1 −1 −34
(3.55x107 M s )(6.626x10 Js)
ΔS =/ = ln( 1 −23 (8.314J/molK) =− 109.6040J/molK
e (1.38x10 J/K)(323.15K)

ΔG=/ = 42 806J/mol − 303.15K(− 108.81J/molK) = 75.791KJ/mol

ΔG=/ = 42 723J/mol − 313.15K(− 109.0893J/molK) = 76.884KJ/mol

ΔG=/ = 42 640J/mol − 323.15K(− 109.3506J/molK) = 77.976KJ/mol

ΔG=/ = 42 557 J/mol − 333.15K(− 109.6040J/molK) = 79.071KJ/mol

Conclusión

Se realizó el seguimiento de la cinética de descomposición de la Urea mediante mediciones de la conductividad

mediante dos experimentaciones, una donde se mantuvo constante la temperatura, para conseguir de esta forma
un valor de la constante de Michaelis a partir de un método gráfico, en el caso particular no fue posible
determinarla aproximando la intersección con un valor de Vmax/2 ya que a ese valor no se cuenta con uno en la
concentración de sustrato, por lo que se despejo de la ecuación de Michaelis-Menten obteniendo un valor muy
similar a la [S] a la velocidad máxima notando así que el valor de Vmax/2 es igual al de la r0. Para el segundo
experimento se mantuvo constante la concentración de sustrato y hubo variaciones en la temperatura de trabajo,
de aquí pudimos obtener el valor de la temperatura óptima, aunque no con exactitud ya que en nuestra
mediciones no se logra observar una disminución de la actividad catalítica, por lo que se hizo una estimación de
que era la más alta medida que fueron 60°C o 333.15K para posteriormente obtener los parámetros de Arrhenius
y con estos los parámetros de activación notando un aumento proporcional al aumento de temperatura en la
=/ =/ =/
ΔS Y ΔG pero no así en la ΔH lo que a partir de una temperatura comienza a disminuir ligeramente y
con esta el calor.