ANÁLISIS COMPARATIVO DE PROTOCOLOS DE
MICROPROPAGACIÓN EN LIMÓN TAHITÍ (Citrus x
latifolia)
Julieth Salcedo Caballero 1
1
Biotecnologia vegetal, Universidad Francisco de Paula Santander, cód. 1611005.
Resumen
El limón Tahití o lima acida pertenece a la familia botánica Rutaceae y al género Citrus; la
cual es catalogada en Colombia como uno de los frutos de mayor producción generando
rendimientos de 15-40 toneladas de fruta por hectárea. La propagación de Citrus x latifolia,
para la producción de plántulas mediante tejidos vegetales en el cultivo in vitro, se lleva a
cabo a partir de técnicas de la Biotecnología vegetal como el cultivo de meristemos, mediante
la disección e incubación del meristemo axilar o apical de una planta en condiciones de
asepsia. El presente artículo tuvo como fin realizar un análisis comparativo de los diferentes
protocolos de micropropagación llevados a cabo en Citrus x latifolia, así como la
comparación de resultados obtenidos, etapas desarrolladas, composición de medios de
cultivo (ambiente químico) y condiciones ambientales (ambiente físico).
Introducción in vitro a condiciones controladas, basada
La micropropagación a partir del en el principio de la totipotencia celular
cultivo de tejidos vegetales (CTV) tiene diferentes fines en los campos de la
realizadas a cultivos de tejidos u órganos agricultura, la industria y la investigación,
tales como; el saneamiento de plantas, la plántulas completas a partir de embriones
propagación masiva, bancos de somáticos o brotes.
germoplasma, obtención de nuevas -Etapa IV / Aclimatación: Transferencia
variedades, estudios fisiológicos diversos de las plántulas y acondicionamiento al
y producción de metabolitos secundarios ambiente ex vitro (Sustrato inerte) [2].
[1]
. El limón Tahití o lima acida pertenece
El establecimiento de CTV para la a la familia botánica Rutaceae y al género
micropropagación obedece a 4 etapas que Citrus; la cual fue introducida a Colombia
consisten en: en 1941[3]. La micropropagación de Citrus
-Etapa 0 / Elección y preparación de la x latifolia, se lleva a partir de herramientas
planta madre: la planta y/o tejido donante de la Biotecnología vegetal como es el
de los explantes deben ser sanas, libres de caso del cultivo de meristemos, los tejidos
contaminación. vegetales compuestos por células no
-Etapa I / Establecimiento de un cultivo diferenciadas o células totipotentes con la
aséptico: Consiste en la metodología para capacidad de formar un organismo
la desinfección de tejidos y su adaptación completo en condiciones ambientales
al medio artificial. físicas y químicas adecuadas [2].
-Etapa II / Multiplicación o La presente investigación tiene como
proliferación: la obtención continúa de fin realizar una revisión y análisis
propágulos o masa vegetal suficiente para comparativo de los diferentes protocolos
la regeneración del número de plantas de micropropagación llevados a cabo en
deseadas. Citrus x latifolia teniendo en cuenta
-Etapa III / Enraizamiento: Formación métodos de regeneración, etapas
de raíces con el objetivo de obtener desarrolladas, resultados obtenidos,
mejores explantes, composición del medio Citrus x latifolia de los estudios
de cultivo y condiciones ambientales. comparados, realizan métodos por cultivo
1. Metodología de meristemos axilares y apicales, así
a) Búsqueda bibliográfica: Se mismo se llevan a cabo técnicas de
realizó una investigación microinjertacion para el problema que
bibliográfica de artículos representa el desarrollo de la etapa III de
científicos y tesis encontradas en enraizamiento. El medio de cultivo
bases de datos. generalmente usado es el medio basal
b) Organización de los datos: Se Murashige y Skoog a un pH de 5.6-5.8.
desarrolló un cuadro comparativo Las condiciones ambientales
para visualizar la información de habitualmente usadas van de un rango de
manera organizada teniendo en 22-27°C, con fotoperiodos de 12-16 horas
cuenta método de regeneración, con un flujo de fotones de 40 µmol/ m2 s1.
etapas desarrolladas, resultados Así mismo varios estudios concuerdan que
obtenidos, composición de medios a bajas concentraciones de citoquinas
de cultivo y condiciones influye positivamente a la formación de
ambientales, realizados en brotes axilares. El cultivo de meristemos
diferentes estudios de axilares en Birreactores (RITA ®) genera
investigación experimental. una mayor producción de brotes en
2. Resultados tratamientos con intervalos de 4 h a
En base a los diferentes métodos de volumen de 40ml de medio de cultivo por
regeneración, el desarrollo de CTV en explante entre inmersiones (tabla 1).
tabla 1. Comparación de protocolos de micropropagación realizados en Limón Tahití- Citrus x latifolia.
Protocolos de micropropagación en Limón Tahití- Citrus x latifolia.
Método de Etapas desarrolladas del Medio de cultivo Condiciones Resultados Referencia
regeneración proceso ambientales obtenidos Bibliográfica
Regeneración a Etapa 0: Se utilizaron Evaluaron 4 medios de-Temperatura de -El 44% fue el Vidal, R., &
partir de segmentos nodales de los cultivos Murashige y incubación: 22°C porcentaje de Marco, V. (2014)
segmentos árboles de lima ácida, variedad Skoog (pH 5.8) con sobrevivencia de los [4].
nodales, vía Tahití, seleccionados de la diferentes reguladores
-Humedad relativa: explantes y el 56%
organogénesis plantación de cítricos de de crecimiento: 60% presentó
directa. Zamorano ubicada en la vega contaminación por
del río Yeguare (13°59'36"N -Tratamiento 0.25 -16 Horas luz. hongos y bacterias.
86°59'26"E). mg/L de BAP (6-
bencilaminopurina) - El MS
Etapa I: la desinfección del suplementado con
material vegetal se realizó con -Tratamiento 0.25 0.25 mg/L de BAP
agua potable y jabón. Se mg/L de Kinetina (6- presentó 78% de
cortaron en segmentos nodales furfurilaminopurina) explantes con brotes
(1.5-2.0cm). Se realizó y con 0.25 mg/L de
desinfección con alcohol al -Tratamiento 0.25 BAP + 0.25 mg/L de
70% durante 20 segundos y mg/L de BAP (6- KIN presento un 70%
luego en una solución de bencilaminopurina) + de explantes con
NaClO al 15% (v/v), con dos 0.25 mg/L de brotes. Siendo los
gotas de Tween 80 por cada 100 Kinetina(6- mejores resultados.
mL de solución (15 min) furfurilaminopurina)
Dentro dela cámara de flujo -El estudio permitió
laminar se extrajo la solución -Testigo sin la evaluación de las
de NaClO y se realizaron tres fitohormonas. citoquinas en la
enjuagues con agua destilada formación de brotes
estéril. axilares.
Se realizaron dos cortes: a 1.0
cm por debajo del meristemo y
a 0.3 cm por encima. y se
procedió a colocar con su parte
basal en el medio de cultivo.
Regeneración a Etapa 0: Explantes de Los medios de cultivo -Temperatura de -El mejor resultado Chamandoosti, F.
partir de segmento nodal de árboles MS con 3% de incubación: 25 ºC para la formación de (s.f) [5]
segmentos jóvenes de un sacarosa brotes fue de 3.2 y 2.6
nodales. año de edad de Jahrom Agrios suplementado con con -16 h de fotoperíodo. brotes por explantes
guardería, Jahrom - Fars – Irán. BA (0 - 8.88 µM), con 4.44 µM de BA,
0.053 µM NAA y 0.053 µM NAA y
Etapa I: Posteriormente de la 0.049 µM IBA. (pH 4.44 µM BA + 0.049
defoliación de los brotes y el 5,8). µM IBA.
corte de 0,5 a 0,7 cm de
longitud, los explantes se -El alargamiento de
esterilizan en la cabina de flujo brotes se produjo en
laminar con inmersión en medio con 4,44 µM
hipoclorito de sodio al 25% de BA + 0,049 µM de
durante 5 min. y se enjuagaron IBA.
en agua destilada 4 - 5 veces.
Etapa II: El número de brotes
multiplicados por explantes y la
duración del ensayo de brotes
multiplicados se realizó en
medios MS con 12
combinaciones de citoquinina
(BA) y auxinas (NAA e IBA)
Bulbarela-Marini,
Cultivo de Etapa 0: Brotes axilares de -MS (Murashige y Los cultivos se -La disponibilidad de J. E., et al., (2019)
[6]
meristemos campo C. latifolia recolectadas Skoog 1962) medio, mantuvieron a 25 ± 2 ° medio de cultivo por
axilares. en las plantaciones de cítricos suplementado con C / 18 ± 2 ° C (día / explante dentro de los
de Cuitláhuac, Veracruz, 100 mg/L de ácido noche), con un flujo biorreactores RITA®
México. ascórbico, 30 g/L de de fotones entre 40 y fue un factor
ácido cítrico, 30 g/L 50 μ mol/m2s1 con un determinante en la
Etapa I: Se realizó de sacarosa y 2.7 g/L fotoperiodo de 16 h multiplicación de
desinfección del explante con de Phytagel™ proporcionado por luz brotes.
30% (v/v) solución de (SigmaAldrich®, St. blanca fluorescente
hipoclorito de sodio Louis, MO) (General Electric -El tratamiento con 4
durante 15 minutos, luego con -pH 5,7 Company, h y volumen de 40ml
70% (v/v) solución de etanol Wayne, PA) durante de medio de cultivo
durante 1 minuto, seguido de un un período de 30 días. por explante entre
enjuague (3 veces) con agua inmersiones resultó
destilada estéril. Se inoculo la en el mayor número
yema axilar en el medio de de brotes.
cultivo.
Etapa II: Se realizó la
multiplicación en un
biorreactor RITA ®, en
intervalos de 4 horas de
inmersión en el medio de
cultivo.
Regeneración a Etapa 0: Se seleccionaron Las Medio de cultivo Todos los explantes se -El porcentaje de dos Santos Souza,
partir de plántulas de lima ácida DBA3, suplementado mantuvieron en explantes con callos E., et al., (2007) [7]
segmentos "Tahití", del invernadero del con 25 g/L de ausencia de luz a una de 0.1-2%.
nodales, Vía Laboratorio de Cultivo de sacarosa, solidificado temperatura de 27º±
organogénesis Tejidos del Centro de Ciencias. con agar (0.8%) y 500 2ºC y más tarde, bajo -La concentración de
indirecta. Ciencias Agrícolas, mg/L de antibiótico un fotoperiodo de 16 3.0 mg/L de BAP
Ambientales y Biológicas de la Ceftriaxona sódica h (40 µmol/ m2s1 de combinada con 0.5
Universidad Federal de (para control intensidad de luz). mg/L de NAA, fue el
Recôncavo da Bahia. bacteriano) y BAP que se destacó
(bencilaminopurina) presentando todos los
Etapa I: Se extrajeron en concentraciones explantes que
segmentos internodales con 0.0; 1.0; 2.0 y 3.0 contenían formación
aproximadamente 1,0 cm de mg/L combinados con de callos e induce a la
longitud, se desinfectaron 0.5 mg/L de NAA
durante 20 minutos en solución (ácido acético de callogénesis in vitro
comercial de hipoclorito de naftaleno) en tejidos adultos.
sodio (2.5%) diluida en agua
destilada en una proporción de
4: 1. Luego se lavaron cuatro
veces en agua destilada y
esterilizada. Los segmentos
internodales se cultivaron
horizontalmente en Placas de
Petri con 20 ml de medio de
cultivo DBA3.
Regeneración a Etapa 0: Se utilizaron medio basal MS Los cultivos se -Los tratamientos Santiana, V., &
partir de meristemas axilares tomados de modificado y incubaron a 22 °C, con 0.25 mg/L de BAP, Wilson, R.
meristemos esquejes de lima ácida-variedad suplementado con humedad relativa de 0.25 mg/L de (2014)[8]
axilares. Tahití- extraídos de la 0.25 mg/L de 6 – 70% a 80%, a 2000 Kinetina y el testigo
plantación de cítricos de Bencil Aminopurina Lux con un sin hormona
Zamorano ubicado en la vega (BAP), 0.25 mg/L de fotoperiodo de 16 presentaron los
del Yeguare (13°59´35''N Kinetina, 1.5 mg/L horas. mejores resultados de
86°59'26''E – 738 msnm) Ácido Giberélico, porcentaje de
0.25 mg/L de BAP + explantes con brote
Etapa I: Los segmentos 0.25 mg/L Kinetina y adventicios.
nodales se desinfectaron con el testigo sin
etanol al 70% por 20 segundos. hormona.
luego se sumergieron solución -pH 5,8
de Hipoclorito de Sodio
(NaClO) al 20% v/v con dos
gotas de Tween 80 por cada 100
ml de solución, por 15 minutos.
En cámara de flujo laminar
horizontal marca EACIN se
extrajo la solución de NaClO,
se realizaron tres lavados con
agua destilada estéril y Se
realizaron cortes longitudinales
en el material vegetal para
extraer el meristemo axilar,
sembrados uno en cada frasco
colocando la parte basal en
contacto con el medio
Regeneración a Etapa 0: Selección de Lima - Medio basal Intensidad lumínica -Las variedad Lima Angarita, H. V.,
partir de Ácida Tahití. (Unifoliado). Los Murashinge y Skoog de 1000 lux durante Ácida Tahití, mostro Montoya, L. A. Z.,
meristemos meristemos se tomaron de (MS) suplementado 12 horas y una un notable & Sánchez, J. E.
apicales. ápices caulinares provenientes con un 20% de temperatura de 27°C prendimiento que V. (s.f) [9]
MICRO- de árboles de campo. Se sacarosa, 5% de Agar. permite su
INJERTACION seleccionaron brotes de 2-3cm manipulación
de longitud para así evitar -pH 5.6-5.7 estándar invitro por
ápices en estado de abscisión. microinjertación de
ápices caulinares para
Etapa I: Se colocaron durante la derivación de
10 minutos en hipoclorito de yemas de plantas de
sodio al 1% adicionado con alta calidad
unas gotas de jabón alcalino. Se fitosanitaria.
enjuagaron por 20 segundos en
alcohol al 70% seguida de
varios enjuagues con agua
destilada esterilizada. Se aisló
el meristemo apical con 2 o 3
primordios foliares y El
meristemo fue colocado en el
corte horizontal, teniendo en
cuenta que quedará la
superficie basal del corte en
contacto con la superficie de la
corteza del patrón expuesto
(semilla).
Etapa II, III, IV: Las plantas
injertadas se mantuvieron en un
cuarto de crecimiento y se
observaron cada cuatro días y
se fueron eliminando los brotes
adventicios producidos por el
patrón. Tres a cuatro semanas
después y con la presencia de 2-
3 hojas expandidas, éstos
microinjertos fueron sacados y
se les realizó un corte en forma
de bisel en el patrón del
microinjerto para ser
reinjertados en patrones de tres
o cuatro meses crecidos en
condiciones de invernadero. El
patrón fue acondicionado con
un buen riego y se practicó un
injerto tradicional con un corte
en forma de T; los injertos
fueron cubiertos con una bolsa
de plástico transparente para
mantener la humedad y se
dejaron en un sitio fresco
durante los primeros días de
adaptación, después fueron
llevados al invernadero donde
permanecieron 2-3 meses para
luego ser llevados al sitio
definitivo en el campo.
Conclusiones la información y el desarrollo de la
El desarrollo de investigaciones con biotecnología, 2, 5-8.
enfoque al CTV, métodos de regeneración, 2. Portillo, L., & Santacruz-
diferentes medios de cultivos, Ruvalcaba, F. (2004). Totipotencia
concentraciones hormonales y celular: Una revisión y aplicación
condiciones ambientales analizadas en los del concepto. Luz María Villarreal
protocolos de micropropagación de de Puga, 13.
especies vegetales de interés para el sector 3. Aguilar, P. F.; Escobar, M. J.;
agrícola e industrial como es el caso de Pássaro, C. P.; Orduz, J. O.;
Citrus x latifolia sirven como base para el Mateus, D. M.; Rebolledo, A.;
desarrollo a escala comercial, sirviendo de León, G.; Mesa, N. C.; Rodríguez,
referencia para establecer las condiciones I. V.; Takumasa, D.; Peronti, A. L.;
óptimas para el desarrollo de CTV Eva, F. K.; Vásquez, S. M.;
enfocadas en la propagación masiva, el Jiménez, C.; Nunes, C.; Palou, L.;
saneamiento de plantas, bancos de Londoño, J.; Álvarez, R.; Sierra, J.;
germoplasma, obtención de nuevas Restrepo, A. M.; Navarro, P.;
variedades y producción de metabolitos Salvador, A. (2012). Cítricos:
secundarios. cultivo, poscosecha e
industrialización. Corporación
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(Citrus aurantiifolia [Christm.] de Carvalho Costa, M. A. P., &
Swingle)-variedad Tahití-a partir Almeida, W. A. B. (2007).
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Agriculture Research, 3(7). Tahití-a partir de meristemas
6. Bulbarela-Marini, J. E., Gómez- axilares.
Merino, F. C., Galindo-Tovar, M. 9. Angarita, H. V., Montoya, L. A. Z.,
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Murguía-González, J., Pastelín- MICROINJERTACIÓN IN-
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