EXTRACCION DE ENZIMAS
Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solucin son a menudo
crticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las
clulas, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de
otras molculas. A veces es necesario pasarlas a solucin como complejo
mucoprotico o nucleoprotico y disociarlo luego durante la purificacin.
Aunque la dispersin de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse
mediante
medios
mecnicos,
en
muchos
complejos
enzimticos
estn
involucradas fuerzas especficas; de la naturaleza de las mismas depende el
mtodo a emplear.
En general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenato, que
implica la destruccin de la clula y el pasaje de las enzimas a solucin o
suspensin. Esto puede llevarse a cabo por:
a)
Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio,
mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o
bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25 M, NaCl
0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer adecuado para controlar
el pH.
b)
Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas
provoca cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular.
Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados
tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos).
c)
Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento rpidos y
repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin
se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al
descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia de
agua pura y se libera su contenido.
d)
Desintegracin qumica: se utilizan agentes que atacan la pared celular,
como el etanol, ter de petrleo, isopentanol, etc.
e)
Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de
protenas por solventes orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se
utiliza acetona en fro.
Fuente y localizacin de la enzima
La actividad de una enzima vara considerablemente en diferentes organismos y
an en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecansticos
generales, debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos
casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la
mayora de las enzimas se deterioran rpidamente. Frecuentemente una buena
eleccin de la fuente de enzima permite simplificar la extraccin y purificacin de
la enzima.
IMPORTANCIA DE LA LOCALIZACION
Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:
I.
Enzimas en solucin verdadera en el citoplasma. Permanecen en el
sobrenadante luego de la eliminacin de los componentes particulados. La ruptura
de las clulas en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio.
II.
Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.).
Pueden encontrarse a) en solucin dentro de una memrana y pueden ser
extradas despus de la destruccin de la misma; b) asociadas a material
lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solucin debe disociarse el complejo.
El conocimiento de la localizacin intracelular y solubilidad relativa de las enzimas
ha permitido desarrollar procedimientos de extraccin diferencial que facilitan la
purificacin.
