5.10.

- PURIFICACION DE ENZIMAS A PARTIR DE ALIMENTOS (REVISIN DE ENZIMAS DE IMPORTANCIA EN ALIMENTOS) Esta seccin mencionar algunos de los aspectos ms relevantes de las enzimas cuyas actividades son importantes en la conservacin y procesamiento de alimentos o en la produccin de materias primas. Se revisarn a las enzimas que hidrolizan carbohidratos, enzimas que hidrolizan protenas, a las que hidrolizan lpidos y otras reacciones enzimticas que son importantes en sistemas alimenticios. En el cuadro se presenta resumen de las aplicaciones ms importantes de enzimas en alimentos.

Aun cuando se sabe que las propiedades de las enzimas in situ pueden ser muy diferentes a las de las enzimas puras estudiadas en el laboratorio, est plenamente justificada la necesidad de tener preparaciones puras para hacer el estudio qumico

completo de su actividad. En la actualidad se han cristalizado o purificado de manera adecuada cerca de unas 200 enzimas (del posible total de unas 5000) y quizs en los prximos aos aumente de modo considerable este nmero. Para extraer las enzimas de las clulas que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; los tratamientos ms enrgicos comprenden la molienda del tejido con arena el empleo de vibraciones ultrasnicas, los procesos alternados de congelamiento y descongelamiento, la autolsis , el desecado con calor o el empleo de solventes como la acetona, el ter y el tolueno. El desecado con acetona y la produccin de los llamados polvos acetnicos constituyen un excelente ejemplo de rotura de la membrana celular y la obtencin de un material rico en enzimas y de fcil conservacin. Cuando las enzimas estn asociadas a lpidos, como sucede con las enzimas mitocondriales, es ventajoso el tratamiento con sustancias de tipo detergente o con butanol que disgregan la estructura lipoprotica y permiten la salida de las enzimas. La purificacin de las enzimas con mtodo de precipitacin fraccionada recurre a diversos procedimientos, el cambio de pH quita las nucleoprotenas y el material grueso, con lo que se facilitan los pasos siguientes. Con el empleo del calor a veces se logra la desnaturalizacin de material proteico inactivo. En otros casos se emplean solventes orgnicos como el etanol, muy utilizado para separar diversas protenas del suero sanguneo y la acetona; o las sales, como el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua, por lo que se puede manejar a elevadas concentraciones, y en general no ataca la estructura de las enzimas. La absorcin fraccional tiene gran utilidad para absorber gran material indeseable o para absorber la enzima y luego desprenderla del material absorbente en una forma ms pura; muy usado con este fin en el gel de aluminio C. En los ltimos aos se han logrado adelantos notables en materia de fraccionamiento proteico con el empleo de tcnicas cromatogrficas en columnas que se basan en fenmenos de absorcin, de intercambio inico o de una verdadera "filtracin molecular". Se agrega a una columna con el material activo la solucin de la enzima que queda fijada a dicho material; se lava la columna con soluciones de sales, cada vez ms concentradas o

con distinto pH, etc. , y se recogen los lavados en fracciones de volmenes determinadas; en alguna porcin sale la enzima en estudio, en forma ms pura. El paso final de la purificacin es el de la cristalizacin de la enzima que debe repetirse varias veces pues los primeros cristales suelen estar contaminados con otras enzimas. A pesar de esto, la obtencin de cristales no demuestra que la enzima est 100% pura, es solo obtencin de una actividad especfica de un valor constante ante las recristalizaciones repetidas la que ofrece la seguridad de su pureza. El estudio de la pureza de una enzima comprende la aplicacin de las tcnicas empleadas para el estudio de la pureza de las protenas, el anlisis por ultracentrfuga, el anlisis electrofortico, etc. Sin embargo, an es posible, si se somete la enzima a fraccionamientos ms sensitivos, como los de la electrofresis en gel de agar, de almidn, o de acrilamida demostrar que la enzima en cuestin puede estar formada por varias protenas, algunas de las cuales tienen la misma actividad enzimtica, pero que por tener propiedades fsicas o estructurales diferentes se deben considerar como isoenzimas, y otras que son protenas que se han procesado a lo largo d todas las etapas de purificacin. En general las enzimas se consideran especies qumicas homogneas y puras cuando llenan requisitos como los siguientes: su actividad no debe aumentar despus de que se la recristaliza repetidas veces; su solubilidad no aumenta al elevar la cantidad de cristales de la protena problema que se pone en solucin; tanto en el anlisis realizado con la ultracentrfuga como en los diversos mtodos electroforticos se encuentra un patrn de movilidad nico y persistente.

5.10.1 PAPAINA, BROMELINA Enzimas que se aplican en la industria de la carne y derivados. PAPANA. Se obtiene por purificacin del zumo lechoso (ltex) coagulado, proveniente de ligeras incisiones longitudinales que se practican en la superficie de los frutos bien desarrollados, pero an no maduros de la papaya (Carica papaya). BROMELINA. Se obtiene por precipitacin con acetona del jugo resultante de la presin de los tallos recin brotados de la Bromelicea, la pia (Ananas comosus, sativa).

FICINA. Se obtiene del ltex coagulado proveniente de cortes o incisiones practicados en los brotes de los tallos de la higuera (Ficus sp.). Se puede purificar la ficina por precipitacin con acetona o etanol, redisolucin en agua, nueva precipitacin con acetona y desecacin al vaco; con un rendimiento de unos 11-12 g de polvo a partir de 100 m1 de ltex (22). PROTEASAS MICROBIANAS. Se obtienen por cultivos de cepas seleccionadas de hongos (Aspergillus oryzae) o bacterias (Bacillus subtilis). Accin: Todas estas proteasas hidrolizan gran nmero de protenas diferentes a travs de polipptidos hasta aminocidos; tambin desdoblan amidas y steres de aminocidos. pH ptimo: 4-8 (vegetal); 2-10 (fngico); 6-2 (bacteriano). Aplicacin: Durante el proceso de maduracin de la carne que sigue al de rigidez cadavrica, las transformaciones autolticas, causadas por sus enzimas proteolticas (catepsinas) suministran a la carne una textura blanda, jugosa, masticable, de sabor agradable y apta para la coccin y digestin (41). Como esta maduracin natural suele ser prolongada (12 das), se puede acelerar artificialmente mediante la adicin de proteasas extraas para as aumentar la ternura de la carne (meat tenderizer). Al atacar por protelisis las fibras musculares y /o los componentes del tejido conectivo (colgeno, elastina, actomiosina) se logra un relajamiento de los enlaces peptdicos de las protenas y con ello el ablandamiento de la carne. Siendo la papana la enzima ms usada para estos fines, existen tambin preparados a base de mezclas de proteasas de origen tanto vegetal como tambin fngico y bacteriano que seran an ms eficaces. Estos ablandadores de la carne se pueden aplicar por pulverizacin, en la superficie, con preparados enzimticos secos, como, p. ej., una mezcla de 88%, de sal de comer (como sustancia portadora); 4,5%, de almidn (para hacerla ms espolvoreable); 4,5% de papana al 1:350, 2% de citrato de sodio cristalizado y 1% de glutamato de sodio, extracto de carne y condimentos. Tambin suelen agregarse polifosfato, glutatin o cistena y cido ascrbico como estabilizadores.

La aplicacin puede efectuarse tambin por inmersin o por dispersin (spray) con soluciones acuosas o hidroalcohlicas de 2 a 5% de la enzima. Despus de 30 minutos y hasta un mximo de 3 horas a la temperatura ordinaria debe procederse a la preparacin culinaria de la carne, como la coccin y el asado rpido (bisteques, escalopas) para evitar que la superficie se vuelva pegajosa. En el caso de carne destinada a ser congelada, se sumergen los trozos en solucin de papana, adicionada eventualmente de cido lctico y sal de comer, y despus de 20 a 30 minutos se congela. Las proteasas, como la papana, pueden aplicarse tambin premortem por inyeccin en la vena yugular hasta 30 minutos antes de la matanza, con el objeto de aprovechar la distribucin homognea de la enzima por efecto de la circulacin sangunea, aunque suelen producirse hemorragias o edemas en rganos internos del animal vivo. Esto puede evitarse por tratamiento previo de la papana o ficina con lcali (pH 11-12), lo que las inactiva en forma reversible. A veces se han observado tambin reacciones defensivas en el organismo del animal vivo que inactivan la enzima inyectada. Este inconveniente no se presentar al hacer la inyeccin postmortem, despus de la matanza, en la arteria del animal desangrado, pero an caliente. Tambin se ha propuesto inyectar premortem compuestos azufrados copio metionina, cistena, glutatin o sales inorgnicas azufradas, que seran capaces de aumentar la actividad de las proteasas naturales del tejido muscular de la carne, las cuales desdoblaran entonces las fibras musculares con efecto de tenderizacin de la carne. En la carne liofilizada la aplicacin de estas proteasas tiene el efecto de facilitar la rehidratacin, al aumentar, por la protelisis, la capacidad de fijacin de agua. Tambin en los pescados tiene lugar, despus de la pesca, una cierta maduracin natural que influye en su sabor y textura. Como en la protelisis de esta maduracin intervienen, fuera de las enzimas del tejido muscular (catepsinas), tambin otras de origen gastrointestinal, stas no podrn actuar si el pescado es eviscerado antes del salado, p. ej., en la preparacin de preservas. En estos casos una adicin de proteasas fngicas al liquido del curado de los trozos fileteados puede ser til, como tambin en la elaboracin de condensados solubles de pescado.

PAPANA La papana que se extrae de la papaya es una enzima proteoltica, es decir, con capacidad para digerir las protenas de los alimentos. Similar a la pepsina, una enzima que est en nuestro jugo gstrico, sus aplicaciones son en distintas reas. La papana se consigue por la extraccin del ltex, que es un lquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros. Luego, en laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel ptimo de calidad para la comercializacin y uso. La enzima se usa en estado lquido y tiene una duracin mnima de seis meses estando refrigerada. La cualidad principal de la papana es el uso como mejorador de las carnes, (ablandamiento y aclaramiento), y el aclaramiento y evitacin de sedimentacin en las cervezas por su accin en los enlaces de las protenas. En la industria cosmtica, se aprovecha su poder desmanchador y cicatrizante. Adems de sus usos en la industria de la carne y la cerveza, esta enzima es requerida en reas como la farmacutica y la cosmtica, donde se utiliza en la fabricacin de cremas desmanchadoras de la piel, que consumen aproximadamente un 10% de la produccin mundial, y van en alza. Por otra parte, la papana es uno de los componentes utilizados por laboratorios oftalmolgicos para fabricar tabletas enzimticas para la limpieza de lentes de contacto. Tambin forma parte de suplementos dietarios, debido a su capacidad de favorecer el proceso digestivo, y de procesos de depuracin de aguas. Paralelamente, se comienzan a descubrir otras aplicaciones de la papana en negocios como la industria textil, papelera, curtido de cuero, as como en procesos de depuracin de residuos lquidos y en investigacin de qumica analtica. Entre los pases que la exportan se encuentran Chile, Tanzania, Uganda, Zaire, Sri Lanka, Tailandia e India.

BROMELINA La Bromelina es una enzima que degrada protenas y que se extrae de la pia. Desde tiempos inmemoriales ha sido utilizada por el hombre americano como efectivo agente

teraputico. Tanto la medicina como la industria moderna utilizan este tipo de enzimas vegetales siguiendo ms o menos los mismos principios que nuestros ancestros. Los isleos beban jugo de pia como una ayuda a la digestin y como cura para el dolor de estmago, en especial luego de una abundante comida; las mujeres lo usaban como agente de limpieza para mejorar la textura de su piel y los guerreros trataban las heridas con la pulpa del fruto para ayudar a la cicatrizacin. En la actualidad, los bioqumicos dedicados a la extraccin de compuestos de origen vegetal han encontrado una explicacin para estos variados usos: la planta de la pia es una rica fuente de Bromelina, una enzima que ayuda a la digestin dado que puede hidrolizar grandes molculas proteicas a pequeos pptidos y aminocidos. El jugo de pia proporciona un activo ingrediente a las lociones para el cuidado de la piel, porque la bromelina que contiene destruye las capas externas, muertas o daadas de la piel quedando expuestas las capas internas ms suaves. Este mismo efecto ha sido usado para la eliminacin de verrugas. Tambin los isleos de Guadalupe hablan descubierto que preparaciones concentradas removan el pelo del cuerpo, esta vez porque la romelina hidroliza otra protena: la queratina, constituyente esencial del pelo. Coln estaba ms interesado en la guerra que en la cosmtica, y se interes vivamente en las capacidades cicatrizantes de la bromelina, que agregaba a su capacidad degradadora de tejido daado una propiedad antisptica, pues atacaba las bacterias dejando la herida limpia y seca. Las aplicaciones teraputicas Cientficos modernos estn investigando un amplio rango de aplicaciones para la bromelina, muchas de las cuales se basan en los antiguos remedios. En primer lugar, la bromelina puede ayudar en el tratamiento de la trombosis coronaria que se caracteriza por un bloqueo de los vasos sanguneos por cogulos estructurados por una protena llamada fibrina. Los ataques al corazn son a menudo causados por un bloqueo de los vasos sanguneos que irrigan el corazn. Una situacin similar se observa en los accidentes vasculares cerebrales.

La formacin de cogulos sanguneos es un proceso que ocurre -naturalmente en individuos normales pero que est controlado por un delicado balance entre la formacin de cogulos y su degradacin. La bromelina parece promover selectivamente la degradacin natural de cogulos de sangre, sin causar hemorragias, en sujetos que presentan bloqueos en vasos sanguneos. La sangre contiene una proteasa natural que degrada cogulos, llamada plasmina, la cual debe ser activada desde su forma inactiva, el plasmingeno. Si este sistema natural no est balanceado, los niveles de plasminas pueden estar bajos, permitiendo que los cogulos persistan y bloqueen los vasos sanguneos. Investigaciones realizadas por Steven Tanssing en Hawai, han demostrado que la bromelina puede estimular la conversin de plasmingeno en plasmina, lo cual permite des-hacer eficientemente los cogulos de fibrina. La bromelina tambin presenta una propiedad "antitrombtica" mediante la cual bloquea la conversin de protrombina en trombina, reduciendo de este modo la formacin de cogulos. El efecto antiinflamatorio de la bromelina est relacionado con este sistema. Trabajos hechos por Taussing y Col. sugieren que la bromelina es una droga antiinflamatoria mejor que las drogas no-esteroidales, tal como lo es la aspirina. Mientras que la aspirina inhibe la sntesis de todas las prostaglandinas, la bromelina es ms selectiva e inhibe la produccin slo de aquellas que aumentan la inflamacin, sin afectar las antinflamatorias. Por su parte, el trauma y el stress prolongado tienden a desplazar el balance hacia las prostaglandnas proinflamatorias, proceso que es contrarrestado por bromelina que tiende a restablecer el equilibrio perdido. A pesar de lo interesante que pueden parecer estos resultados, se requiere aun de mayor informacin acerca del posible mecanismo de accin a travs del cual la bromelina acta en el organismo. El efecto teraputico de bromelina puede, de este modo estar dado por la actividad protesica o por otro componente del extracto del tallo, como son aunque parezca paradojal, los inhibidores de proteasas". La bromelina, es un tipo de enzima proteoltica la cual puede ser separada del jugo de los tallos de pia por precipitacin en una solucin de metanol. Esta ha sido ampliamente conocida y usada en los diez aos pasados. En la industria de alimentos, su

mayor aplicacin es en el macerado o ablandado de la carne, en el enfriamiento de la cerveza, en productos de protenas solubilizadas, en desechos de pescados, as como tambin, en la produccin de protenas hidrolizadas. Tambin ha sido utilizado en propsitos tiles tal como protenas digestivas para desordenes internos. Los residuos de los tallos de pia, como producto derivado del procesamiento de bromelina, pueden ser usado como un aditivo en alimentos animales y como un medio para el cultivo de plantas tales como orqudeas y plantas de t. Una apreciacin del valor del citrato de calcio, producto derivado de la refinacin del cido ctrico, tambin es un producto derivado en el procesamiento de bromelina. Por lo tanto, la produccin industrial de la bromelina tiene un elevado valor aditivo. .