本文介绍了如何在基因差异表达分析后使用KEGG和GO数据库进行富集分析，包括富集分析的概念、步骤，以及如何在R中使用`clusterProfiler`包进行环境设置、数据读取、统计分析和可视化结果。重点讲解了如何进行环境配置、导入DEGs数据、进行GO和KEGG数据库的分析，并展示了基础的柱状图和气泡图可视化方法。
基础生信分析——富集分析（1）
前言
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GO（Gene Ontology）是两种常用的基因功能和通路富集分析方法，可以帮助研究人员理解基因集合中的功能和通路特征。以下是对KEGG/GO富集分析的简要介绍：
KEGG富集分析：KEGG富集分析基于KEGG数据库，对基因集合中的基因进行功能注释和通路富集分析。通过将基因集合与KEGG数据库中的通路注释进行比较，可以确定哪些通路在给定基因集合中过度表示。这有助于理解基因集合中的生物学过程、信号传导通路或代谢通路的重要性。
GO富集分析：GO富集分析基于Gene Ontology，它是一个标准化的基因和蛋白质功能注释系统。GO由三个纬度组成：分子功能（Molecular Function）、细胞组分（Cellular Component）和生物过程（Biological Process）。GO富集分析可以帮助确定给定基因集合中具有显著富集的功能或过程。
这两种富集分析方法通常包括以下步骤：
基因集定义：首先，需要明确你感兴趣的基因集合，可以是差异表达基因、某个生物学过程相关的基因等。
统计显著性分析：在富集分析中，使用统计方法（如超几何分布、Fisher’s精确检验等）来衡量基因集与注释数据库中的功能或通路之间的关联性，并确定哪些功能或通路在基因集中过度表示。
多重假设检验校正：由于分析过程中进行了多次比较，通常需要进行多重假设检验校正，例如Bonferroni、Benjamini-Hochberg调整等。
结果解释：根据分析结果，可以识别出在给定基因集合中显著富集的KEGG通路或GO功能，并进一步解释这些富集结果的生物学意义。
KEGG/GO富集分析是生物学研究中常用的功能注释和通路分析方法，可以帮助研究人员洞察基因集背后的生物学特性和功能，从而深入理解基因集的生物学意义。
一、富集分析是什么？
简单来说，差异分析之后我们仍然获得非常多的DEGs，我们需要进一步对这些DEGs做一些功能注释或者对某些特点功能和通路的基因做深度筛选，这时候就需要进行富集分析，也叫功能分析
二、使用步骤
1.环境
# 下载所需要的R包 ----------------------------------------------------------------
if (!require("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
# 检查 clusterProfiler 包是否已经安装
if (!require("clusterProfiler", quietly = TRUE)) {
# 如果未安装，则使用 BiocManager 安装
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("clusterProfiler")
}
# 检查 org.Hs.eg.db 包是否已经安装
if (!require("org.Hs.eg.db", quietly = TRUE)) {
# 如果未安装，则使用 BiocManager 安装
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("org.Hs.eg.db")
}
# 检查 ggplot2 包是否已经安装
if (!require("ggplot2", quietly = TRUE)) {
# 如果未安装，则使用 install.packages 函数安装
install.packages("ggplot2")
}
# 检查 dplyr 包是否已经安装
if (!require("dplyr", quietly = TRUE)) {
# 如果未安装，则使用 install.packages 函数安装
install.packages("dplyr")
}
# 检查 ggsci 包是否已经安装
if (!require("ggsci", quietly = TRUE)) {
# 如果未安装，则使用 install.packages 函数安装
install.packages("ggsci")
}
# 检查 GOplot 包是否已经安装
if (!require("GOplot", quietly = TRUE)) {
# 如果未安装，则使用 install.packages 函数安装
install.packages("GOplot")
}
# 加载所需要的R包 ----------------------------------------------------------------
library(clusterProfiler) #富集分析主要的包
library(org.Hs.eg.db)#查找物种注释信息
library(ggplot2)#分面绘图所需
library(dplyr)#整理数据
library(ggsci)#配色
library(GOplot)#可视化
2.读入DEGs数据
# 读取数据：基因差异分析的结果 ----------------------------------------------------------
Gene <- read.csv("DEG_deseq2.csv",row.names = 1)
Genes <- bitr(Gene$Gene_symbol,
fromType = "SYMBOL", #输入数据的类型
toType = c("ENTREZID"), #要转换的数据类型
OrgDb = org.Hs.eg.db) #物种
3.GO数据库
分析计算
# GO富集分析 --------------------------------------------------------------------
GO <- enrichGO(gene = Genes$ENTREZID, #输入基因的"ENTREZID"
OrgDb = org.Hs.eg.db,#注释信息
keyType = "ENTREZID",
ont = "all", #可选条目BP/CC/MF
pAdjustMethod = "BH", #p值的校正方式
pvalueCutoff = 1, #pvalue的阈值
qvalueCutoff = 1, #qvalue的阈值
minGSSize = 5,
maxGSSize = 5000,
readable = TRUE) #是否将entrez id转换为symbol
GO_result <- as.data.frame(GO)#转化结果
可视化
# 基础柱状图 -------------------------------------------------------------------
barplot(GO)#单个条目
barplot(GO, drop = TRUE, showCategory =6,split="ONTOLOGY") +
facet_grid(ONTOLOGY~.,scale='free')#多个条目
# 美化版本 --------------------------------------------------------------------
#挑选每个分类中前10显著的条目
BP_top10 <- GO_result %>%
filter(ONTOLOGY == "BP") %>% # 筛选 ONTOLOGY 为 BP 的子集
arrange(p.adjust) %>% # 按照 p.adjust 的升序排列
head(10) # 提取前 10行
CC_top10 <- GO_result %>%
filter(ONTOLOGY == "CC") %>% # 筛选 ONTOLOGY 为 CC 的子集
arrange(p.adjust) %>% # 按照 p.adjust 的升序排列
head(10) # 提取前 10行
MF_top10 <- GO_result %>%
filter(ONTOLOGY == "MF") %>% # 筛选 ONTOLOGY 为 MF 的子集
arrange(p.adjust) %>% # 按照 p.adjust 的升序排列
head(10) # 提取前 10行
merge_data <- rbind(BP_top10,CC_top10,MF_top10)#合并三个条目
merge_data$ONTOLOGY <- factor(merge_data$ONTOLOGY, levels = c("BP", "CC","MF"))
merge_data$logPvalue <- (-log(merge_data$p.adjust))#数据处理
colnames(merge_data)#检查列名
merge_data$Description <- factor(merge_data$Description, levels = unique(merge_data$Description[order(merge_data$ONTOLOGY)]))
ggplot(merge_data, aes(x = Description, y = logPvalue, fill = ONTOLOGY)) + #指定数据为merge_data，以Description作为x轴，以logPvalue作为y轴，以ONTOLOGY作为颜色填充。
geom_bar(stat = "identity", width = 0.8, color = "black") + #添加一个柱状图层，使用identity统计方法（不进行任何变换），每个柱子的宽度为0.8，颜色为黑色
scale_x_discrete(limits = unique(merge_data$Description[order(merge_data$ONTOLOGY)])) + #设置x轴的标签顺序，根据ONTOLOGY对Description排序，以便按照ONTOLOGY的顺序显示。unique()函数保证每个标签只出现一次。
coord_flip() + #翻转坐标轴，交换x轴和y轴，使得柱状图变为横向。
scale_y_continuous(expand = c(0,0))+ #设置y轴的范围为连续型变量（continuous），设置expand参数为c(0,0)，意味着y轴不需要扩展（不需要增加额外的空白）。
theme(panel.background = element_rect(fill = "white"))+ #设置背景为白色，使用element_rect()函数设置元素的矩形形状
theme(axis.text = element_text(size = 16, family = "Arial"),
axis.title = element_text(size=18,family="Arial",colour = "black"),
legend.text = element_text(size = 16, family = "Arial"),
legend.title = element_text(size = 18, family = "Arial"),
legend.position = "top")+ #设置各种文本元素的字体、大小和颜色，包括坐标轴文本、坐标轴标题、图例文本和图例标题。将图例放置在顶部。
labs(x = "GO term", y = "-log P-value")+
scale_fill_nejm(alpha = 0.8) #使用NEJM（New England Journal of Medicine）颜色调色板，设置颜色透明度为0.8，对填充颜色进行比例缩放。
3.KEGG数据库
分析计算
# KEGG富集分析----------------------------------------------------------------
KEGG <- enrichKEGG(gene = Genes$ENTREZID,
organism = "hsa",
keyType = "kegg", #KEGG数据库
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 1,
qvalueCutoff = 1)
可视化
#柱状图----------------------------------------------------------------------
barplot(KEGG,
x = "GeneRatio",
color = "p.adjust",
showCategory = 10,
title = "KEGG_enrichment")
# 气泡图----------------------------------------------------------------------
#根据基因count数排序
dotplot(KEGG)
#根据P值排序
df <- as.data.frame(KEGG)#转换数据
df_sorted <- df[order(df$p.adjust), ][1:10, ]#前10名
colnames(df_sorted)
df_sorted$Description
df_sorted$Description <- gsub(" - Homo sapiens \\(human\\)", "", df_sorted$Description)
ggplot(df_sorted, aes(x=GeneRatio, y=Description, size=-log10(p.adjust), color=p.adjust)) + ## 生成散点图，以GeneRatio为x轴，Description为y轴，-log10(p.adjust)为点的大小，p.adjust为点的颜色
geom_point(alpha=0.7) + # 绘制散点图层，设置透明度为0.7
scale_color_gradient(low="blue", high="red") +
labs(title="The most enrichment KEGG pathway", x="GeneRatio", y="KEGG pathway", size="-log10(P-value)", color="P-value") + #设置颜色映射为渐变色，低值为蓝色，高值为红色
theme_minimal() + #设置图表的标题、x轴和y轴标签，以及点的大小和颜色的图例标签
theme(axis.text.y = element_text(face = 'bold',size = 12),
axis.title = element_text(size = 15),
plot.title = element_text(size = 18, face = "bold")) #设置主题为最小化主题，调整y轴的文本大小和字体粗细，以及标题、轴标签的字体大小
总结
以上是简单的对DEGs做GO/KEGG富集分析
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